BD FACSCalibur中文培训手册

目 录

第一章流式细胞仪简介 (1)

1.1 流式细胞术发展史 (1)

1.2 流式细胞仪构造和工作原理 (2)

1.2.1 概述 (2)

1.2.2 流式细胞仪构造 (2)

1.3 流式细胞仪的主要技术指标 (10)

第二章 FACSCalibur 的日常操作 (12)

2.1 FACSCalibur系统 (12)

2.2 FACSCalibur开机程序 (15)

2.3 FACSCalibur关机程序 (16)

2.4 FACSCalibur的维护与保养 (17)

2.4.1 FACSCalibur的每月维护 (17)

2.4.2 FACSCalibur的定期维护 (18)

2.5 常见故障排除 (20)

第三章 FACSComp软件 (22)

3.1 FACSComp简介 (22)

3.1.1 FACSComp运行条件 (22)

3.1.2 FACSComp的文件类型 (23)

3.2 FACSComp的功能 (24)

3.2.1 光电倍增管（PMT）电压的调节 (24)

3.2.2 荧光补偿的调节 (24)

3.2.3 灵敏度的测试 (24)

3.2.4 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT） (25)

3.2.5 HLA-B27的校准 (25)

3.2.6 LeucoCOUNT (25)

3.2.7 优化 (25)

3.3 FACSComp的运行 (25)

3.3.1 CaliBRITE Beads的准备 (25)

3.3.2 软件环境的设置 (26)

3.3.3 Beads的检测 (26)

3.3.4 Optimization (28)

3.4 Troubleshooting (28)

第四章 FACStation 数据管理系统 (30)

4.1 FACStation 数据管理系统组成 (30)

4.2 FACStation文件组成 (31)

4.2.1 如何建立文件夹 (31)

4.2.2 FACStation文件的类型 (31)

4.2.3 如何管理文件 (32)

4.3 实用的Macintosh OS X功能 (34)

4.3.1 菜单栏 (35)

4.3.2 Dock (37)

4.3.3 查找窗口 (37)

4.3.4 键盘快捷键 (38)

4.4 如何设置模版 (39)

4.5 实验练习：如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 (40)

4.6 可选性存储装置 (40)

4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则 (40)

4.6.2 光驱的维护 (41)

4.6.3 光盘的维护 (41)

第五章 CellQuest Pro软件 (42)

5.1 概述 (42)

5.1.1 获取(Acquisition） (42)

5.1.2 分析(Analysis) (42)

5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) (42)

5.2 工具栏 (42)

5.3 CellQuest Pro 的文件 (43)

5.3.1 FCS数据文件 (43)

5.3.2 实验文件 (44)

5.3.3 仪器条件文件 (44)

5.3.4 统计文件 (44)

5.4 CellQuest Pro 的仪器控制 (44)

5.4.1 探测器 (45)

5.4.2 放大器 (45)

5.4.3 阈值 (46)

5.4.4 补偿 (46)

5.4.5 状态 (47)

5.5 CellQuest Pro 的视图 (48)

5.6 练习：3色或4色数据获取 (48)

5.6.1 质控－运行FACSComp (48)

5.6.2 优化 (50)

5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 (52)

5.6.4 调节FSC/SSC探测器（电压）及FSC阈值 (53)

5.6.5 设置淋巴细胞Region (53)

5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压） (53)

5.6.7 调节荧光补偿 (55)

5.7 实验练习：3色/4色预获取 (55)

5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口 (56)

5.7.2 设置Parameter Description (57)

5.7.3 编辑Reagent Panel (58)

5.8 实验练习：数据获取 (59)

5.9 储存、恢复仪器设置 (60)

5.9.1 储存仪器设置 (60)

5.9.2 恢复仪器设置 (60)

5.10 储存实验模板文件 (60)

5.11 练习：数据分析 (60)

5.11.1 画Region (61)

5.11.2 限定象限marker (61)

5.11.3 分析四色 (63)

5.11.4 批分析其余数据 (63)

5.11.5 分析数据 (64)

5.11.6 将分析文件以模板形式保存 (64)

5.11.7 创建文具簿（stationery pad） (64)

5.11.8 将统计改为电子表格 (65)

5.12 Regions 和Gating（画门） (65)

5.12.1 设置Region (65)

5.12.2 改变Region (65)

5.12.3 用Region 统计来分析数据 (66)

5.12.4 门 (66)

5.12.5 多色门 (66)

5.12.6 组合门 (67)

5.12.7 在直方图上使用组合门分析 (68)

第六章 FACSCalibur 分选 (69)

6.1 分选概述 (69)

6.1.1 收集系统 (69)

6.1.2 分选模式 (70)

6.2 分选窗口 (71)

6.2.1 Sort Setup (71)

6.2.2 Sort Counters (72)

6.3 准备收集管 (72)

6.4 分选 (73)

6.4.1 清洗分选管线 (73)

6.4.2 准备 (73)

6.4.3 收集分选前数据 (74)

6.4.4 分选条件设置 (74)

6.4.5 分选目的细胞 (74)

6.4.6 清洗分选管路 (75)

6.4.7 浓缩样本 (76)

6.5 检验分选纯度 (76)

6.6 分选问题讨论 (77)

6.7 FACSCalibur无菌分选 (79)

6.8 分选细胞浓缩系统 (80)

6.8.1 系统简介 (80)

6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备 (81)

6.8.3 确定气压参数 (82)

6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选 (82)

6.8.5 分选浓缩细胞 (84)

6.8.6 从分选管路中回收细胞 (84)

6.8.7 回收细胞做进一步分析 (85)

6.8.8 清洗分选管路 (85)

6.8.9 清洗浓缩器 (85)

第七章 DNA分析 (87)

7.1 概述 (87)

7.2 细胞周期 (87)

7.3 DNA检测的常用术语 (87)

7.3.1 Coefficient of Variation（CV）：变异系数 (87)

7.3.2 DNA index（DI）：DNA指数 (88)

7.3.3 Ploidy：倍体 (88)

7.4 影响流式DNA分析的因素 (88)

7.4.1 分辨率（CV） (88)

7.4.2 线性度 (88)

7.4.3 碎片 (88)

7.4.4 细胞双粘体 (89)

7.5 DNA质量控制（DNA QC Particles） (89)

7.5.1 样本制备 (89)

7.5.2 上机检测 (89)

7.5.3 常见错误排除 (90)

7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据 (91)

7.6.1 样本制备 (91)

7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据 (92)

7.6.3 质量控制 (95)

7.7 用ModFit 软件分析DNA数据 (95)

7.7.1 运用ModFit 进行自动分析 (96)

7.7.2 运用ModFit 进行手动分析 (96)

7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析 (98)

7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析 (98)

第八章 HLA-B27分析 (99)

8.1 检测HLA-B27的意义 (99)

8.2 HLA-B27的检测方法 (99)

8.2.1 传统方法 (99)

8.2.2 流式细胞术 (100)

8.2.3 试剂盒介绍 (100)

8.2.4 实验原理 (100)

8.2.5 样本的收集和准备 (101)

8.2.6 流式检测 (102)

8.3 质量控制 (110)

附录1：组织相容性抗原和疾病的关系 (111)

附录2：强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病 (112)

第九章 MultiSET软件 (113)

9.1 简介 (113)

9.2 MultiSET运行条件 (114)

9.3 MultiSET文件类型 (115)

9.4 MultiSET软件内容 (116)

9.4.1 MultiSET界面功能分区 (116)

9.4.2 MultiSET命令菜单 (116)

9.4.3 MultiSET实验报告 (117)

9.4.4 MultiSET运行程序 (117)

9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences (126)

9.6 Control Panels (绝对计数质控) (128)

9.7 MultiSET画门及Attractor方案 (128)

9.8 注意事项及常见问题处理 (129)

第十章练习题 (135)

10.1 补偿 (135)

10.2 流式简介 (135)

10.3 CellQuest 获取与分析 (136)

10.4 分选 (139)

BD F ACSCalibur 中文培训手册

第一章流式细胞仪简介

1.1 流式细胞术发展史

纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进，流式细胞仪的研制、革新，到今天的众多应用领域的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和物理学等学科知识综合运用的结晶。而现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域的应用有了更加突飞猛进的发展。而这一切，就要求我们的流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科的知识，只有这样，才能更好地将流式细胞仪应用到我们的临床和科研中去。

流式细胞术发展史

1930年，Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数。

1934年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞。

1936年，Caspersson 等引入显微光度术。

1940年，Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白。

1947年，Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器。

1949年，Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法的专利。

1950年，Caspersson 用显微分光光度计的方法在UV和可见光光谱区检测细胞。

1953年，Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动数器。

同年，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。

1954年，Beirne 和Hutcheon 发明光电粒子计数器

1959年，B型Coulter计数器

1965年，Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光度计定量细胞成分；二是结合测量值对细胞分类。

1967年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基础上提出细胞分选的方法。

1969年，Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM（即现在的National Flow Cytometry Resource Labs）发明第一台荧光检测细胞计。

1972年，Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。

1975年，Kohler 和Milstein 提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。

1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。

从此，大量的厂家不断研制生产出自己的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时1流式细胞仪简介1

BD F ACSCalibur 中文培训手册代。科学家们、仪器制造商们又纷纷将研究焦点转向荧光染料的开发、细胞的制备方法和提高电子信号的处理能力上来。进入九十年代，流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善，而随之而来的就是应用领域的日趋广泛。而今，流式细胞仪已经深入到生物学、医学、药物学等的各个分支领域，并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用。

1.2 流式细胞仪构造和工作原理

1.2.1 概述

流式细胞仪（Flow Cytometer 简称FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器的问世,科技工作者进行了不懈的努力。随着各相关技术的迅速发展，FCM技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的工具。

FCM仪器分为二大类：一类为台式机，其特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。BD公司的临床型FCM FACScan也是最早获得美国FDA批准可用于临床诊断的仪器。另一类为大型机，其特点为可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。

1.2.2 流式细胞仪构造

图一

FCM的结构一般可分为五部分：(1)流动室及液流驱动系统; (2)激光光源及光束成形系统; (3)光学系统; (4)信号检测与存贮、显示、分析系统，(5)细胞分选系统。见图一。

(一)、流动室与液流驱动系统

流动室(Flow Chamber或 Flow Cell)是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻2

1流式细胞仪简介

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