分子生物学实验课程讲稿
其优点是：不需要准备大量的植物组织，而且适合像叶、根、种子、胚、胚乳、花粉和悬浮培养的组织等多种类型的组织。 试剂和器材
1）1M Tris-Cl (ppH8.0) 500ml 60.57gTris 调pH8.0
2）2xCTAB分离缓冲液 100ml 2% CTAB 2g
1.4mol/L NaCl 8.18g
20mmol/L EDTA 0.74g EDTA-Na2.2H2O 100mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 10ml 1mol/L Tris-Cl(pH8.0) 0.2% β-巯基乙醇 0.2ml 3）洗涤缓冲液 100ml
76% 乙醇 76ml无水乙醇 10mmol/L 乙酸铵 0.077g乙酸铵 4）TE缓冲液
10mmol/L Tris-Cl(pH7.4) 1mmol/L EDTA 5）氯仿-异戊醇（24：1） 6）液氮
7）研钵，恒温水浴，离心机，离心管 8）SDS裂解液
3％ SDS
0.15mol/L EDTA(pH8.0) 0.05 mol/L Tris-Cl(pH8.0) 0.2 mol/L NaCl
0.2% β-巯基乙醇
9）1.3mol/L醋酸钾（1.38g醋酸钾配成10ml）
实验步骤
1、CTAB法提取植物基因组DNA
1）将5ml CTAB分离液加入50ml离心管中，置于60℃水浴中预热。
2）称取1.5g叶子，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。 3）取1g粉末直接加入预热的CTAB分离液中，轻轻转动使之混匀。 4）样品于65℃保温30分钟
5）加等体积（5ml）的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀
6）室温下4000rpm离心10分钟
7）吸取上层水相于另一个干净的离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置20分钟，使核酸沉淀下来。10000rpm离心10分钟，弃上清。
8）加入10-20ml洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来，离心洗涤数次。室温下使DNA沉淀干燥
9）将DNA沉淀溶于1-1.5ml TE中，-20℃保存备用。
10）取10ul稀释10倍，测定OD260nm、OD280nm；取5-10ulDNA溶液做0.8%的琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的大小和质量。
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分子生物学实验课程讲稿
结果分析
1． 用紫外分光光度计在260nm、 280nm波长分别读数。其中OD260nm/OD280nm为1.8，则说明为DNA。电泳结果为：完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带, 若降解则成为弥散状。电泳前缘为未除干净的RNA。
2．如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可以在取材前将植物放暗处24hr，以达到去除淀粉的目的。 3. DNA沉淀呈棕色，难以酶切植物材料含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现，可在加入2 ×CTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇，或者加入亚精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亚精胺）。
4．DNA中含有多糖或盐类将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次，吹干后重溶于TE中。（注意乙醇一定要吹干, 否则电泳点样时, 样品上漂）
5．DNA已降解电泳条带呈弥散状样品降解可能有两种情况：一是机械振动过剧烈，二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡，提取液及用品要高温高压灭菌。另外，使用Tip头吸取过程中应避免产生气泡，Tip头应剪去Tip头尖，避免反复冻融DNA。
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分子生物学实验课程讲稿 实验三：动物基因组DNA的提取
实验目的：
1、掌握用SDS法从动物组织中提取DNA的原理合方法 实验原理：
核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类，在真核细胞中，DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于细胞质和核仁里，在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白释放出来。
在浓氯化钠溶液（1－2mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液（0.14mol/L）中，DNA核蛋白溶解度很小，RNA核蛋白溶解度很大，因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
分离得到核蛋白后，需要进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：1）用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。2）用SDS等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。3）用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内，吸出上层水相，将其注入两倍体积的95％乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯地DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异戊醇分级沉淀时即被除去。
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：1）物理因素，因为DNA分子量较大，机械张力或高温很容易使DNA分子发生断裂。因此，在操作过程中应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移及剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA的损伤，同时也应避免过高的温度。2）酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温（0℃左右）下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐（EDTA-Na）等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。 3）化学因素，核酸的结构在一定的pH范围内稳定，所以在DNA提取的实验中，设计了许多可供选择的分离缓冲液。分离缓冲液的pH值应避免接近降解酶的最适点。大多数降解酶和脂肪氧合酶pH值的最适点在5.0－6.0之间，而DNA酶pH值最适点在7.0左右。由于在过酸的条件下，DNA脱嘌呤会导致DNA的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂，所以大多数提取缓冲液的pH值在8.0，有的甚至为9.0。
1、SDS法提取动物基因组DNA原理
将抽提得到的核蛋白用SDS处理，DNA(RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中，向溶液中加入适量乙醇，DNA即可析出。 试剂和器材
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分子生物学实验课程讲稿
1）1M Tris-Cl (ppH8.0) 500ml 60.57gTris 调pH8.0 2）SDS裂解液
3％ SDS
0.15mol/L EDTA(pH8.0) 0.05 mol/L Tris-Cl(pH8.0)
0.2 mol/L NaCl
0.2% β-巯基乙醇
3）洗涤缓冲液 100ml
76% 乙醇 76ml无水乙醇 10mmol/L 乙酸铵 0.077g乙酸铵 4）TE缓冲液
10mmol/L Tris-Cl(pH7.4) 1mmol/L EDTA 5）氯仿-异戊醇（24：1） 6）液氮
7）研钵，恒温水浴，离心机，离心管
8）1.3mol/L醋酸钾（1.38g醋酸钾配成10ml） 实验步骤
1、SDS法提取动物基因组DNA
1)称取2－3g动物组织冰上研磨成浆糊状（加少量石英沙），加入3mlSDS裂解液转移到10ml离心管中，用2mlSDS裂解液清洗研钵一起转移到离心管中 2）65℃保温30分钟
3）5000rpm离心10分钟，取上清到一个新的离心管中。 4）加入4.5ml醋酸钾溶液，混匀
5）10000rpm离心10分钟，取上清到一个新的离心管中 6）加入0.6－1倍体积的异丙醇，混匀，室温放置20分钟
7）10000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用70％乙醇洗2－3次，风干。 8）加入200ulTE溶解DNA沉淀，取10ul稀释10倍，测定OD260nm、OD280nm；取5-10ulDNA溶液做0.8%的琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的大小和质量。 结果分析
1． 用紫外分光光度计在260nm、 280nm波长分别读数。其中OD260nm/OD280nm为1.8，则说明为DNA。电泳结果为：完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带, 若降解则成为弥散状。电泳前缘为未除干净的RNA。
2．如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可以在取材前将植物放暗处24hr，以达到去除淀粉的目的。
3. DNA沉淀呈棕色，难以酶切植物材料含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现，可在加入2 ×CTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇，或者加入亚精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亚精胺）。
4．DNA中含有多糖或盐类将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次，吹干后重溶于TE中。（注意乙醇一定要吹
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