一、室常见细胞系细胞培养基应用选择
细胞类细胞系 型 种 组 织 培养基 成纤维293 细胞 人 胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清 上皮细HeLa 胞 人 子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA(in suspension, S-MEM) 上皮细HEp-2 胞 人 喉癌 MEM, 10% 胎牛血清;或RPMI-1640, 10% 胎牛血清 骨髓性成淋巴K-562 细胞 病 人 的白血RPMI-1640, 10% 胎牛血清 成纤维BHK-21 细胞 仓肾 鼠 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA 上皮细CHO-K1 胞 仓卵巢 鼠 F-12,10%胎牛血清 成纤维Vero 细胞 小鼠单小RAW264.7 核巨噬鼠 细胞 猴 非洲绿199培养基，5%胎牛血清 猴肾 DMEM高糖培养基，腹水 10?S,1%P/S 上皮细PK-15 胞 上皮细MDBK 胞 内皮细PIEC 胞
二、冻存和细胞复苏的方法步骤 细胞的冻存 一、概述
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、细胞冻存操作步骤：
(1)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。
(2)去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。
猪 髋动脉 RPMI，胎牛血清10% 牛 肾 清，10% RPMI1640(w/oHepes)优质胎牛血猪 肾 EMEM+10%Hyclone灭活血清 (3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。
(4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时(此步可省略)，再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。
细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。 三、常用冷冻设备和材料
常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点： (1)一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。
(2)液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。 (3)在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。
细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿(或专用细胞冻存管)、吸管、离心管、喷灯、纱布袋(或冻存管架)等。 细胞的复苏 一、细胞复苏的原则
在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 二、细胞复苏的主要操作步骤
(1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。 (3)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。
若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。 三、注意事项
在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。
三、鼠巨噬细胞RAW264.7为例，具体介绍细胞培养技巧
RAW264.7是由Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得到的细胞株。该细胞具有很强的黏附和吞噬抗原的能力，是微生物学、免疫学研究中的常用细胞株。
RAW264.7细胞培养之前，一切与该细胞直接接触的玻璃器皿和器具都要进过去热处理 （200-250℃烘烤4-6h），RAW264.7细胞接触过多的热源会导致巨噬细胞形态发生明显变异，影响实验中的观察。培养细胞的相关试剂在分装时也尽量减少热源的污染。这样，RAW264.7 细胞的状态才可能达到最好，确保实验的可靠性和真实性。
RAW264.7细胞是类单核的细胞，最好的形态是小的圆形透亮的细胞。极易出现多伪足的细胞形态，这是造成很多研究者困惑的原因，同时这也是之后细胞的消化和传代困难的根源。RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促使细胞伸出伪足，增强黏附攀爬能力。
胰酶的消化效果与细胞的形态有紧密的关系。细胞的伪足多而长，会使细胞很难消化，用细胞刮对细胞损伤较大，需要的贴壁的时间更长，增值速度也会很慢。因此往往RAW264.7 的消化是传代中工作量最大的步骤。 经验做法：
1）待培养瓶中 RAW264.7 细胞的密度达到 80%，弃去培养基；
2）用HBSS 洗液洗涤两次，完全去除含胎牛血清的培养基（以免影响胰酶的消化效果）；3）0.25%胰酶消化5-10min。形态好（指小、 圆形）的细胞5min就可达到理想的消化效果；
4）弯嘴吸管稍用力均匀吹打，重复一次，即可将 RAW264.7细胞吹打下来。但是形态不好（多触角、 长梭形）的细胞即使消化10min后，镜下观察，悬浮的RAW264.7细胞都很少，
这时的细胞状态就不太好，对后续的实验有较大的影响。 四、吞噬实验
将RAW264.7细胞接种于细胞培养板中，待细胞长成单层后，用PBS洗涤3次，加入无抗的DMEM培养液（Hyclone），加入培养至对数生长期的细菌，使MOI达到10:1（细菌：细胞），于37℃作用30min。吸出培养液，用PBS洗3次，加入DMEM培养液（含100微克/毫升氨苄青霉素）用以杀灭结合于细胞表面的细菌。孵育2h后，用PBS洗涤细胞3次后，用无菌双蒸水裂解细胞。对细胞裂解液进行梯度稀释，将其涂布在含有10%灭活牛血清的TSA的培养基上，37℃培养过夜，确定其中含有的细菌数目。 五、粘附与侵入实验
将Hep-2细胞接种于细胞培养板上，待细胞长成单层后，用PBS洗涤3次，加入无抗的DMEM培养液（Hyclone），加入培养至对数生长期的细菌，使MOI达到100：1，于37℃作用2h。吸出培养液，用PBS洗3次，用无菌双蒸水裂解细胞，对细胞裂解液进行梯度稀释，将其涂布在含有10%灭活牛血清的TSA的培养基上，37℃培养过夜，以计算侵入细胞内的和粘附于细胞表面的总细菌数目。对于仅计算侵入细胞内的细菌数目，PBS洗涤后，加入DMEM培养液（含100微克/毫升氨苄青霉素）处理细胞2h，后用无菌双蒸水裂解细胞，进行培养计数。
六、细胞毒性实验
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