蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化

1.溶菌酶活性的测定

采用浊度法,用60mmol／L、pH6．2的磷酸缓冲液配制一定浊度0450--0．6\．7)的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodleikticus)为底物，取0．1mL酶液加入2．5mL底物(20℃)中，在波长450nm处读取反应体系3minl勾每隔1 5s的吸光度。以△彳45dmin变化0．001个吸光度值为一个活性单位。 酶活力=△450nm／lminx0．001 x0．1mL 式中：△450nm--lmin内吸光度的变化

2.阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的，PH7.4只是作为缓冲保证蛋白活性的，你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱，一般都是氯化钠，从0摩尔开始，逐渐增加盐的浓度，上限不定

3.上样过程是这样的，首先是样品上柱，这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的，这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白，接下来在用无盐buffer冲洗一定的柱体积，会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白，然后再用含盐的buffer洗脱，这一步要逐渐增加盐的浓度，可以拉线性也可以走梯度，一般不会直接用1摩尔的盐洗脱，应为1摩尔的盐基本上能洗脱阴离子柱上所有的蛋白了。

4.作酶的纯化时，每一部分，包括穿透峰，都应该做酶活测定，因为在事先是不能肯定需要纯化的蛋白是否就一定挂上柱了，只有当确定了目的蛋白对某种柱子的结合之后，确定穿透峰里面没有目的蛋白，才可以不用测定活性。否则就可能带来损失。 5.【1】分离胶的浓度和最佳分离范围： （1）SDS-PAGE分离胶浓度 －－－ 最佳分离范围 （KD) 6%胶 －－－－ －－－－－－－－50-150 8%胶 －－－－ －－－－－－－－30-90 10%胶 －－－－－－－－－－－－20-80 12%胶 －－－－－－－－－－－－10－40

（2）分离胶浓度（％） －－－ 线性分离范围（KD) 15 －－－－－ －－－－－－ －－12-43 10 －－－－ －－－－－－－－－16-68 7.5 －－－－－－－－－－－－36-94

5.0 －－－－ －－－－－－－ －57-212 【2】浓缩胶一般都是选4％或者5％ 下面是5％胶的配制方法：

成分 ----- 配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 5%胶 － － 2 － － 3 － － 4 － － 6 － － 8 － － 10

蒸馏水 － － 1.4 － － 2.1 － － 2.7 － － 4.1 － － 5.5 － － 6.8 30?r-Bis(29:1) － － 0.33 － － 0.5 － － 0.67 － － 1.0 － － 1.3 － － 1.7

1M Tris, pH8.8 － － 0.25 － － 0.38 － － 0.5 － － 0.75 － － 1.0 － － 1.25

10%SDS －－ 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 －－ 0.06 － － 0.08 － － 0.1 10%过硫酸铵 － － 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 － － 0.06 －－－ 0.08 － － 0.1

TEMED － － 0.002 －－ 0.003 －－ 0.004 － － 0.006－ － 0.008 － － 0.01 6.酶液应在-5~-20℃下冻存，量大的话建议浓缩冻干，若制成酶粉的话可在4℃下保藏 7.对于酶的纯化 建议你不要过柱子 这样浪费时间又得到的纯品少，用等电点把不同分子量

的酶给分离开，在用冷冻离心机把酶给分离出来，这样快而且酶还不失活。试一试吧。

实验室蛋白常用试剂配方

来源：生物谷 2008-10-22 访问量：9685 评论(0) 分享0

1、PBS:

取ZLI-9061 PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2~7.4之间，若偏离此范围，请用0.1N的HCL或NaOH调整。 2、TBS：

2.1 Tris缓冲液配方：（0.5 M pH7.6） Tris（三羟甲基氨基甲烷） 60.57g 1N HCL 约420ml 双蒸水 加至1000ml

Tris缓冲液配制方法：

先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1N）或NaOH（1N）将pH调至7.6， 最后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。 2.2 TBS配方：

Tris-HCI缓冲液（0.5M pH7.6） 100ml NaCI 8.5~9g (0.15mol/L) 双蒸水 加至1000ml TBS配制方法：

先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。 3、枸橼酸盐缓冲液（Citrate buffer）： 3.1 储存液：

A. 0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸（C6H8O7·H20）溶于1000ml蒸馏水中。

B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸钠（C6H5Na3O7·2H20）溶于1000ml蒸馏水中。 3.2 工作液：

取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值应为6.0 0.1 4、胰酶（Trypsin）：

4.1 ZLI-9011胰蛋白酶消化液：

常用浓度为0.125%，即使用前将一滴试剂1胰酶溶液和三滴试剂2胰酶稀释液均匀混合（1:3稀释），则可直接滴加使用。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%（1:10稀释）至0.25%（1:1稀释）。

4.2 ZLI-9010胰蛋白酶：

取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或 0.1% pH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。 5、胃酶（Pepsin）：

4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL配制。 6、DAB：

6.1 ZLI-9032/9033 DAB Kit：

使用前只需将试剂盒提供的A、B、C三种试剂各一滴加至1ml双蒸水中，即可获得1ml DAB工作液，简单易用。

6.1 ZLI-9030 DAB：

6mgDAB溶于10mlTBS（0.05M pH7.6），再加入0.1ml浓度为3％的H2O2，过滤掉沉淀物，即可。 7、AEC：

4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml浓度为0.1M的醋酸缓冲液（pH5.2），然后加入0.15ml 3%H2O2，过滤掉沉淀物。 8、RIPA：

1×PBS，1%NP 40，0.5 sodium deoxycholate，0.1% SDS（此液体可长期保存）。以下抑制剂以储存液方式保存，临用前加入RIPA中。

8.1 10mg/ml PMSF异丙醇溶液（用量为10 l/ml）

8.2 Aprotinin（Sigma产品，用量为30 l/ml） 8.3 1000mM sodium orthovanadate冷冻液 （用量为10 l/ml） 9、Blotto A：

常规使用1×PBS，5% milk，0.05% Tween 20。 10、Blotto B：

与Phosphotyrosine抗体共用，1×PBS，1% milk，0.05% Tween 20。部分实验中milk可完全去除，但可能引起背景增高。

从牛奶中分离酪蛋白和乳糖

一、引言

牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，

胶粒直径约为20～800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。 二、实验材料和试剂 脱脂乳或脱脂奶粉。

醋酸-醋酸钠缓冲溶液（PH=4.7），95%乙醇，乙醚，碳酸钙粉末，苯肼试剂。 三、实验步骤

1. 从牛奶中分离酪蛋白

在烧杯中加入2g脱脂奶粉，再加入40ml40℃，PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml， 用PH精密试纸检验液体的PH值。静置冷却至室温，倾去上层清液（留作分离乳糖用），剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中，用转速为2000转/分离心分离3～5分钟，倾出上层清液，（合并于上一清液中），得酪蛋白粗品。于离心管中加入5ml蒸馏水，用玻棒充分搅拌，洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及残留的缓冲溶液），离心后弃去上层液，再用蒸馏水洗一次。于试管中加入5ml95%乙醇，充分搅拌，离心后弃去乙醇溶液，用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质。最后再用5ml乙醚以同样方法洗涤，以除去脂肪类物质。将酪蛋白沉淀物凉干，称重、并计算得率。 2. 从牛奶中分离乳糖

在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。