150) 我提取了一些水溶性多糖，但含大量的色素。我想用分子筛或离子交换将色素与多
糖分开，不知可行吗？色素会不会粘在填料上将填料污染？
只能说试试,色素种类很多,多糖也是如此,我也没有做过,只能试试.
你试试MCI GEL吧，这个东西分色素非常出色。 你找这个公司要资料吧。
010-51528296
sales@herbs-extract.com 151) 我想纯化一蛋白，分子量10kd左右，目的蛋白来自血液中，浓度大概为每毫升20
纳克左右，其他性质不详。手边暂时没有bio-rad蛋白质纯化用mini-protein电泳仪，无法用tricine-sds-page纯化。反相液相色谱柱c18又太贵，有没有其他比较好而且又经济的方案？谢谢。
只能在离子交换, 凝胶过滤, 疏水中去试吧.这么低的含量,先建立好的检测方法最要紧. 152) 你好, 我没做过层析,我想纯化经胃蛋白酶消化的血浆蛋白, 使产物F(ab')2含量达
到80%以上. 现在的工艺F(ab')2含量在45-65% . 请教大规模层析方案. 一次处理量为100万毫升, 蛋白含量约2% .
我觉得可以在疏水和离子交换的办法中去试.你的样品中主要的杂质是白蛋白和IgG吧,你也可以把这些物质去掉达到去除杂质提高纯度的目的.
153) 我想问一下Ｃ８柱用于分离蛋白质或肽类物质时，怎样选择洗脱的试剂？我对ＨＰ
ＬＣ不懂，但现在需要用！谢谢！
你查一篇文献就知道了,比较简单,就是低浓度的乙腈水加三氟乙酸平衡柱子,然后在用高浓度的乙腈水加三氟乙酸线性剃度洗脱,基本就这样,具体的浓度要自己看你蛋白特性而调整了.不少HPLC的文献都有具体的方法.
154) 今天花了一个晚上浏览，收获蛮大，我的问题是这样：纯化GST融合蛋白（加上
GST共90kD多），用amersham的1ml柱，曾经纯化出来，但酶切后就不见目的蛋白，只见GST，这次更悬，没有加凝血酶切，但洗脱柱后就在GST大小附近有带，菌液预先小量诱导有目的条带（90kD，没有GST条带），不知道是什么原因，诱导条件：IPTG0.1mM，26～29度3小时。细菌离心后用PBS重悬，-80度反复冻融3次，蛋白酶抑制剂只加了PMSF，超声（可能有点过，有部分泡沫），加tritonX100后RT摇20min，添加DTT至10mM（操作手册说可以增加跟柱的结合）后10000g离心，上清过柱按说明操作。SDS-PAGE的结果，沉淀仍然有大量目的条带，过柱前的上清的同一位置就只有很淡条带，过柱后相类似，PBS洗出液里蛋白就较稀少，但关键洗脱液中就只见约26kD的条带，怀疑GST，但从何而来？
我曾经按此步骤纯化过分子量比较小的一个蛋白（含GST约55kD），纯化得率还可以，但这次失败的原因是什么呢？
我怀疑是超声过了也许断裂了,所以这样,或者使蛋白变性都有可能,至于切了没有目标蛋白会不会切了以后不稳定,就沉淀在柱子上,这样就只有切的了,你可以用变性剂看看能不能洗下来东西.我想这是原因吧.
谢谢chromatography的教导，现在我已经决定不切除GST，凝血酶也很贵，不成功，则成＃％￥，所以，应该GST对研究影响不大吧。
是不是融合蛋白在融合位点就特别脆弱呢？我添加的DTT是不是也有影响？怎样超声不会太过？我500ml菌液浓缩到15mlPBS，超声几次都还很粘稠，请再给予指点。 变性剂是指哪些？
此外，听您讲有国产的层析柱还是怎样，可否给小弟一些资料？
我不做上游,但是处理的时候,书上是写如果超声的强度过大,时间过长,有可能会变性或者断裂,加DTT有没有影响我不很清楚,预处理这个问题你还是问问外面做表达和提取的人吧.变性剂常用的是尿素和盐酸胍
155) 我的酶蛋白单体分子量约为90KD，其四聚体的分子量约为360。
我现在用的凝胶柱是S-200，是不是不大合适？此外，做SDS-PAGE时，有一条杂蛋白，和我的目标蛋白距离很近，一直分不开。不知道该怎么办？
你纯化出来应该是不错的,因为这样你的目标蛋白正好在纯化范围外,至于很近的杂质有没有可能是降解的产物呢,其实你也可以用s-100试试.如果没有,那就用现在的吧
156) 我在做一个核内定位的蛋白，预测等电点是10，60KD。做过好久的亲和纯化，有
N端his-tag，C端his-tag, 还有N端GST-tag的，纯化时的问题都一样：包涵体表达为主，上清含量很少。用低离子强度的PBS破菌的化，上清中含量会多一些，但是蛋白不挂亲和柱。洗脱出来的微量目的蛋白中目标蛋白只占很少一部分，用透析，PEG浓缩等等操作又都能使蛋白完全沉淀。上清用硫酸铵沉淀浓缩以后过疏水柱也不挂，也试过阴、阳离子柱，还是不挂柱。因为蛋白活性未知，所以我不倾向于做包涵体纯化，但是也曾经试过分级洗涤提包涵体蛋白，都没能拿到比较纯的包涵体，而且在包涵体中his－tag耦连的该蛋白也不挂柱，很迷惑，在变性条件下不应该存在tag被蛋白屏蔽的问题吧？
既然是包涵体本身应该有一定的纯度，不挂柱，那你用的是哪家的产品呢，此外怎么操作呢，你能说详细点吗，有的时候也许结合力比较弱，所以要选择镍密度高的填料，延长作用时间，提高pH值，降低流速，一般天然结构不挂的时候有，但是变性不挂很难理解，此外你的样品里有没有别的物质干扰挂柱，原因挺多的，所以需要你说详细点。
我用的亲和柱是qiageon的Ni-NTA agrose，应该不是镍柱质量问题，用这套操作体系纯化过几个其他his-蛋白效果都很理想，至于是不是有其他物质干扰我也不能确定，但是我试过这么多载体和tag，效果都一样，就觉得是蛋白本身性质的问题了
据说在靠近等电点附近的ph条件下，8M尿素体系的his蛋白是不挂柱的，不知是不是有这个情况，但是据预测的数据来看，好像ph8.0的缓冲体系应该不存在这个问题的
至于操作呢，亲和纯化我们用的都是agrose，在离心管里agrose与菌体上清4 度或者室温结合2hr～过夜不等，结合条件应该是很充分的了，很迷惑
另外如果是86KD的蛋白与其他60KD以下的杂带分开的话，用哪种型号的分子筛来做HPLC合适呢？
做HPLC的话那你可以用TSK系列的凝胶柱,不过处理不了多少样品,虽然每家都产镍柱,他们的产品其实结构是不一样的,而效果也会有一些差别,因此我建议你可以换一种填料试试,没有听说哪家的填料是最好的,我没有用过这个公司的填料,但是它的结构我很清楚,我个人感觉这个填料的吸附力是比较弱的,因为我看过一般洗脱通常在200-300uM咪唑之间,而且由于它的填料结构是有三个螯合基团螯合镍离子,而通常用的只有两个,这样剩余用在和his作用的镍离子的价数就少一个,这样必然会吸附力不如只有两个的,这是我个人的见解.我用的填料有不少洗脱要在300-400mM咪唑,可见作用力还是有差别的,结构也是有差别的,这些差别和琼脂糖没有关系,只和配基本身的结构有关.
如果你说的pH的问题,那你可以再提高pH看看,反正是变性的,无所谓,你提高的10或者10.5看看,也许这样能挂住.
此外你也可以考虑换个别的离子看看能不能挂柱,不过好象你的填料也没有办法换离子,这个也是它的缺陷.
157) 我用离子层析得到人总IgG，含有IgG1,IgG2,IgG3,IgG4，然后用亲和层析获得各
个亚类，它们的分子量分别为：146，146，170，146，分子量差别很小，用常规的SDS-PAGE+考马斯亮兰很难鉴定它们的纯度，请问用何方法来鉴定它们的各自纯度。
哦,什么亲和能把这几个亚类分开,我记得好象说只有羟基磷灰石能把一些亚类分开,至于鉴别我没有做过,我觉得只能用专门检测亚型的试剂盒去检测他们了.
158) 请问：DEAE-和CM-纤维素柱用完后可以用20%的酒精过柱保存吗？或用1M醋酸
钠 pH3.0？
还有它们的上样浓度一般在什么范围内？有没有什么要求？
应该可以用20%乙醇保存,就是柱子中填料也许会缩小一些,用醋酸钠也需要加防腐剂例如叠氮钠等把,否则也会长菌的.
上样的浓度应该关系不大,只和上样的总蛋白量有关,你可以查他们的载量,我觉得一般的离子交换填料的上样量也就在>20mg/ml左右,太高我没有上过. 159) 我现在想用蛋白来亲和纯化我的抗体 蛋白SDS-PAGE就有一条带，但western效果很差 所以我想进一步纯化一下蛋白，来亲和纯化抗体 现在我想电洗脱来纯化一下蛋白
但对用考染后的蛋白是不是可以用于亲和柱来纯化抗体呢
具体应注意什么问题呢
变性的蛋白既然能免疫,那么直接偶联到填料上做成柱子来纯化你的抗体应该没有问题,但是变性后的蛋白偶联很麻烦,因为如果你的变性蛋白要在盐酸胍或者脲里溶液,那它们都有氨基也许也会和活化的填料偶联,所以你的蛋白在普通缓冲液中能溶解才成.考染后的蛋白估计是不适合做抗体的配基,你可以跑电泳只切一条染色,这样知道位置后再把剩下电泳板切胶电洗脱就可以.我没有做过这个实验,所以抱歉,你可以在DXY里搜索,你会找到电洗脱的一些帖子的.
160) 请问chromatography : 我用QIAGEN公司的Ni-NTA纯化his tag 融合蛋白,杂带
忒多,摸过很多条件,做过很多不同的蛋白,结果都一样.能否麻烦老兄寄一份his纯化的资料让我好好学习学习.
我已经把材料发给你了,你可以参考一下,或者改用我们公司的镍琼脂糖凝胶试试.去除这些杂带一般可以用降低pH洗脱,同时在缓冲液里加一些非离子表面活性剂,这样可以降低非特异吸附.
161) 你好版主！我想请教一个问题：8M尿素溶解的蛋白能否直接做疏水或凝胶层析？
另外separose 4FF分离2万左右分子量的蛋白效果会如何？如果改成 6FF应该怎样换介质？
8M尿素溶解的蛋白不加盐的话估计是挂不住的,你可以降低一点脲的浓度,这样才能保证硫酸铵能溶解在这里面.做凝胶过滤得小心点,在变性的条件下,蛋白都是线性分子,凝胶过滤是很难分开的.用separose系列分离这么小的效果也不会好的,除非是差别很大,即使separose6FF也未必好用.
162) 请问chromatography 师兄, 纯化his蛋白,用降低pH洗脱和梯度咪唑洗脱有什么
不同吗? 梯度ph洗难道不会使蛋白变性吗?
低pH和咪唑不一样,降低pH可以减弱蛋白和金属离子的作用离,这样吸附弱的蛋白容易被洗脱,而咪唑是竞争洗脱,它们原理是不同的,互相配合可以使一些咪唑洗不去的杂带洗掉,低pH也就到4-5左右,短时间不少蛋白不会变性的.
163) 偶纯化一个原核表达的热休克蛋白融合蛋白，超声裂菌后40％硫酸铵沉淀，然后
DEAE Sepharose FF纯化下来纯度85%左右，有3条杂带，分别为130KD+、～55KD、～45KD，目标蛋白分子量为74KD，偶的要求是要达到电泳纯所以偶选了phenyl做进一步纯化，可是偶的这个蛋白比较奇怪2M NaCl才能挂柱，（用硫酸铵的话还没挂柱就沉淀了），可是挂上之后0M NaCl也洗不下来，而且杂蛋白的性质和目标蛋白很象也弄不下来，是不是偶的疏水做的有问题呀？还有一个问题就是国产的柱子和仪器哪家的比较好？我现在用的柱子没有接头，对拉梯度会不会有很大影响？
其实你这个操作我觉得你可以这样,沉淀后直接上疏水,然后再过离子交换,至于你说的沉淀你可以稀释到低一些的硫酸铵蛋白就不沉淀了,它不需要那么高的浓度,一般1.5M左右看有没有沉淀,能不能挂在柱子上,洗脱洗不下来可以在洗脱液体中加5-10%的甘油或者乙二醇,
相关推荐：
loading