第二章 工艺设计
在27 ℃下培养24～28h，然后将种子培养液接种到发酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中，通入无菌空气，搅拌，在27 ℃下培养7天。在发酵过程中需补入苯乙酸前体及适量的培养基。②提取精制：将青霉素发酵液冷却，过滤。滤液在pH2～2.5的条件下，于萃取机内用醋酸丁酯进行多级逆流萃取，得到丁酯萃取液，转入pH7.0～7.2的缓冲液中，然后再转入丁酯中，将此丁酯萃取液经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得青霉素G钾盐。青霉素G钠盐是将青霉素G钾盐通过离子交换树脂（钠型）而制得。
2.3.2 半合成青霉素的生产方法
以6APA为中间体与多种化学合成有机酸进行酰化反应，可制得各种类型的半合成青霉素。
6APA是利用微生物产生的青霉素酰化酶裂解青霉素G或V而得到。酶反应一般在40～50 ℃、pH8～10的条件下进行；近年来，酶固相化技术已应用于6APA生产，简化了裂解工艺过程。6APA也可从青霉素G用化学法来裂解制得，但成本较高。侧链的引入系将相应的有机酸先用氯化剂制成酰氯，然后根据酰氯的稳定性在水或有机溶剂中，以无机或有机碱为缩合剂，与6APA进行酰化反应。缩合反应也可以在裂解液中直接进行而不需分离出6APA。
因产天然青霉素法生产工艺较半合成青霉素法简单，而且采用发酵罐培养，每批次生产效率高，而半合成法对工艺要求较高，且中间物质较多，可能存在生产中中间体转化不完等因素，而且成本较高，所以本设计采用天然青霉素的生产方法。
2.4 常见发酵方式
根据操作方式的不同，发酵过程主要有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型。
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2.4.1 分批发酵
营养物和菌种一次加人进行培养，直到结束放出，中间除了空气进人和尾气排出，与外部没有物料交换。传统的生物产品发酵多用此过程，它除了控制温度和pH及通气以外，不进行任何其他控制，操作简单。但从细胞所处的环境来看，则明显改变，发酵初期营养物过多可能抑制微生物的生长，而发酵的中后期可能又因为营养物减少而降低培养效率，从细胞的增殖来说，初期细胞浓度低，增长慢，后期细胞浓度虽高，但营养物浓度过低也长不快，总的生产能力不是很高。 其优点是：①对温度的要求低，工艺操作简单；②比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；③对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。缺点是：①人力、物力、动力消耗较大；②生产周期较短，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段； ③生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的 g 数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。
2.4.2 连续发酵
所谓连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期。在稳定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物浓度、产物浓度、pH值等都能保持恒定，微生物细胞的浓度及其比生长速率也可维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速度。连续发酵具有以下优点： ①可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定；②能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会；③减少设备清洗。准备和灭菌等非生产占用时间，
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第二章 工艺设计
提高设备利用率，节省劳动力和工时；④由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长，节约了成本；⑤容易对过程进行优化控制，有效地提高发酵产率。 当然，他也存在一些缺点: ①由于是开放系统，加上发酵周期长，容易造成杂菌污染；②在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异；③对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高；④粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内结团，给连续发酵 操作带来困难。由于上述情况，连续发酵目前主要用于研究工作中，如发酵动力学参数的测定，过程条件的优化试验等等，而在工业生产中的应用还不多。连续培养方法可用于面包酵母和饲料酵母的生产，以及有机废水的活性污泥处理。而新近发展的一种培养方法则是把固定化细胞技术和连续培养方法结合起来，用于生产丙酮、丁醇、正丁醇、异丙醇等重要工业溶剂。
2.4.3 补料分批发酵
补料分批发酵又称流加发酵，半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。如今，流加发酵的应用范围已相当广泛，包括单细胞蛋白、氨基酸、生长激素、抗生素、维生素、酶制剂、有机酸等生产几乎遍及整个发酵行业。流加发酵（补料分批发酵）与分批发酵相比，特点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点：①可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧矛盾。②避免在培养基中积累有毒代谢物，即代谢阻遏。与连续发酵相比，流加发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题，因此，其应用范围较广。对于好氧发酵，它可以避免在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况，还可以在某些情况下减少菌体
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生成量，提高有用产物的转化率 在真菌培养中，菌丝的减少可以降低发酵液的粘度，便士物料输送及后处理 与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异问题，其适用范围也比连续发酵广。
青霉素合成阶段，青霉素的生产速率达到最大，菌体重量增加，碳源、氮源等营养物质不断消耗，青霉素不断合成。因为存在着抗生素合成和菌体合成二条不同的代谢途径，需要严格控制发酵条件，以利抗生素合成代谢的进行。一般在这个阶段，发酵液中碳源、氮源和磷酸盐等营养物质的浓度必须控制在一定范围内，才有利于青霉素合成。而且微生物合成含有苄基基团的青霉素G，需在发酵中加入前体苯乙酰胺。因一次加入量不能大于0.1%，所以采用多次加入方式。因此采用补料分批发酵可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证青霉素的生长需要，又不造成不利影响，还可以避免在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况，从而提高有用产物的转化率，所以本设计采用补料分批发酵方式进行青霉素的发酵生产。
2.5 工艺特点
本设计工艺为三级发酵[3]，一级种子罐→二级种子罐→发酵罐。一级种子罐、二级种子罐培养时间短，一次性投入培养基，中间不补料，发酵罐考虑到各种由于底物浓度过高引起的底物抑制情况以及产物合成期对营养成分的需求，采用中间补料。主要补油、补糖、补氨水调解pH。一级种子罐采用实罐消毒，二级种子罐、发酵罐培养基采用连续消毒。一级种子罐体积小采用夹套换热，二级种子罐采用内蛇管，发酵罐用外盘管加内蛇管换热，内蛇管也作为罐内挡板，以加强罐内料混合程度。
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