南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2018，49（2）：375-3822期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·375·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.02.26无乳链球菌感染吉富品系尼罗罗非鱼
的病理学研究
罗
伟，甘
西，朱佳杰*，敖秋桅，谭
芸，陈
明，罗永巨
530021）
（广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，南宁
摘要：【目的】确定无乳链球菌侵染吉富品系尼罗罗非鱼的途径及靶器官，为罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据。【方法】分别采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染，然后采集感染罗非鱼的鳃、脾脏、肝脏和小肠组织进行病理形态学观察，并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位，明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其浸染的靶器官。【结果】3种人工感染方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌，其中，腹腔注射和经口灌胃在感染2h后即出现病理变化，而体外浸泡感染方式出现病理变化的时间约在感染5h后，且病变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻。免疫组织化学定位发现，腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的病原菌信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠，经口灌胃组的病原菌信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏，体外浸泡组的病原菌信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠。【结论】采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌，其对应的病原菌信号分别优先在脾脏、肠道和鳃组织出现。因此，自然养殖条件下防止养殖水体和食源被无乳链球菌污染是防控罗非鱼无乳链球菌病暴发的有效措施。
关键词：吉富品系尼罗罗非鱼；无乳链球菌；致病途径；靶器官；免疫组织化学中图分类号：S941.42
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2018）02-0375-08
PathologicalresearchofGIFTtilapiainfectedby
Streptococcusagalactiae
LUOWei，GANXi，ZHUJia-jie*，AOQiu-wei，TANYun，CHENMing，LUOYong-ju
（GuangxiAcademyofFisheryScience/GuangxiKeyLabofAquaticGeneticBreedingandHealthyAquaculture，
Nanning530021，China）Abstract：【Objective】TheinfectionapproachofStreptococcusagalactiaetoGIFTtilapiaandtargetorganswerestu-diedtoprovidereferencefordiseaseresistantbreedinganddevelopmentofS.agalactiaevaccine.【Method】TheGIFTtila-piawasinoculatedbyS.agalactiaethroughintraperitonealinjection，gavageandsoak，andsamplesofgill，spleen，liver
andsmallgutwerecollectedforpathomorphologyobservation.Immunohistochemicallocationwasconductedusinganti-S.agalactiaeserumofrabbittoresearchthedistributionregulationsineachtissuesundervariousinoculationapproachesandtheinoculatedtargetorgans.【Result】ThethreeartificialinoculationmethodscouldallleadtoS.agalactiaeinocula-tionofGIFTtilapia.Inintraperitonealinjectionandgavageinoculations，pathologicalchangesoccuredafter2hofinocu-lation，butinsoakinoculation，pathologicalchangesoccuredafter5h，andthedegreeofpathologicalchangeswaslessseriousthantheothertwo.Immunohistochemicallocalizationresultsshowedthat，inintraperitonealinjectiontreatment，theorderofpathogenicbacteriaoccuredinGIFTtilapiawasspleen→liverandgill→smallgut；theorderingavageinocu-lationwassmallgut→gillandspleen→liver；andtheorderinsoakinoculationwasgill→spleen→liverandsmallgut.【Conclusion】Intraperitonealinjection，gavageandsoakcanallleadtoS.agalactiaeinoculationinGIFTtilapia.Thesig-nalofpathogenicbacteriawouldappearfirstinspleen，gutandgill.Therefore，theeffectivemeasurestocontroltheout-breakofS.agalactiaediseaseinGIFTtilapiaundernaturalaquacultureconditionsarepreventingtheaquaculturewaterandfoodfrominfectionofS.agalactiae.
Keywords：GIFTtilapia；Streptococcusagalactiae；pathogenicpathway；targetorgan；immunohistochemistry收稿日期：2017-07-12
基金项目：广西科技重大专项项目（桂科AA17204080-2）；广西重点研发计划项目（桂科AB16380077）；国家特色淡水鱼产业技术
体系建设项目（CARS-46）；广西八桂学者专项项目（桂科政字〔2013〕25号）
作者简介：*为通讯作者，朱佳杰（1981-），副研究员，主要从事罗非鱼遗传育种与健康养殖研究工作，E-mail：724790058@qq.com。
罗伟（1991-），主要从事水产健康养殖研究工作，E-mail：991468441@qq.com
·376·南方农业学报49卷0引言
【研究意义】无乳链球菌（Streptococcusagalac-tiae）是广泛存在于自然界中的条件致病菌，可危害水产养殖中的不同鱼类品种，包括罗非鱼（Oreo-chromisniloticus）、卵形鲳鯵（Trachinotusovatus）、斑点叉尾鮰（Ietaluruspunetaus）、石斑鱼（Epinephe-lussp.）等（Jafaretal.，2008；Amaletal.，2012；刘溪等，2015；郭长明等，2017；张德锋等，2017）。自2009年以来，随着罗非鱼规模化养殖模式的大面积推广，其病害日趋严重，尤其是无乳链球菌病危害呈逐渐递增趋势。该病死亡率高，传播速度快，但至今尚未找到完全根治的方法。因此，亟待开展罗非鱼抗病品系选育研究以保障其产业的健康持续发展，而开展罗非鱼抗无乳链球菌病育种的前提必须明确罗非鱼对无乳链球菌侵染的免疫应答机制。【前人研究进展】目前，有关病原菌感染鱼类的免疫应答机制研究已有报道。Skirpstunas和Baldwin（2002）研究发现，爱德华氏菌（Edwardsiellaictaluri）通过肠道上皮细胞侵入斑点叉尾鮰体内，从而引起肠道败血症；Co-tter等（2005）研究发现，海豚链球菌（Streptococcusiniae）最先感染罗非鱼的胃肠组织，随后通过局部扩散作用进入血液循环系统，最后进入神经中枢系统而引发脑膜炎等症状；Tu等（2010）研究证实，嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）通过肠道感染鲤鱼Cyprinuscarpio），且感染5周后还能从其肠道中分离出病原菌；但郭松林等（2011）研究发现，嗜水气单胞菌感染欧洲鳗鲡（Anguillaanguilla）时最先出现在肾脏组织，随后通过循环系统扩散至全身而引发病症；张永华（2012）采用实时荧光定量PCR检测副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）感染斑马鱼（Da-niorerio）前后IL-1β、IFN和TNF的mRNA转录水平，结果表明，3种炎性细胞因子的表达水平与感染方式密切相关，但随着感染时间的延长均呈先升高后降低的变化趋势；Peatmana等（2013）研究证实，柱状黄杆菌（Flavobacteriumcloumnare）感染斑点叉尾鮰的第一靶器官是鳃组织；季策（2017）研究表明，Notch1a在Notch信号通路中可能通过抑制irak家族及NFκB家族基因而抑制TLR通路传导，在副溶血弧菌感染斑马鱼2h时负向调节nfkbiaa、cxcl18b、cx-cr3、il11r、c3a、cfb、myhb、myh11a、serpinf2a、ctss2和ctslb等基因的表达，进而调控斑马鱼的天然免疫应答机制。【本研究切入点】目前国内有关罗非鱼无乳链球菌病的研究主要集中在病原菌分离鉴定（柯剑等，2010；郭玉娟等，2012）、毒力因子筛选（邓永强和
汪开毓，2016；方伟等，2016）、药物防治（华亚南等，
2016；梁志凌等，2016）及疫苗研发（李莉萍等，2015；王瑞等，2015）等方面，而针对其致病途径及感染后罗非鱼机体内组织的病理学研究报道甚少。【拟解决的关键问题】通过腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染，然后采集感染罗非鱼的鳃、肠、脾脏和肝脏组织进行病理形态学观察，并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位，明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其侵染的靶器官，为吉富品系尼罗罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据。
1材料与方法
1.1
试验材料
供试吉富品系尼罗罗非鱼取自广西南宁国家级罗非鱼良种场，SPF级成年兔购自广西医科大学实验动物中心，无乳链球菌株（HN016）由广西水产科学研究院鱼病防治研究室保存提供。HN016菌株解冻后直接接种于鸡血培养基上，30℃培养18~24h，长出菌落后随机挑取单个菌落进行革兰氏染色，检测其是否携带杂菌；然后挑取单个菌落接种至200mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，摇床上32℃培养24h，以无菌生理盐水稀释至1×107CFU/mL，4℃保存备用。
1.2无乳链球菌感染方式
分别采用腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染，感染试验鱼置于3m3的水体大桶中养殖，水温控制在30~31℃，每天投喂膨化饵料2次，每隔3d换水1次1/2）。感染后每隔1h观察统计1次罗非鱼的发病或死亡情况，并及时捞出病鱼、死鱼。1.3病理形态学观察
采集无乳链球菌感染罗非鱼的肝脏、脾脏、鳃和小肠等组织，以Bouin’s液进行固定，经梯度脱水、石蜡包埋切片和HE染色后（王晶等，2011），于显微镜下观察不同组织的病理变化。
1.4无乳链球菌免疫组化兔一抗血清制备
经复壮培养的HN016菌液用0.08%甲醛在28℃振荡器（300r/min）上灭活过夜，以PBS将其浓度调至5×108CFU/mL，与弗氏完全佐剂按1∶1混匀，即获得无乳链球菌HN016免疫原混合液。然后选取5只SPF级成年兔，在其背部皮下分点注射无乳链球菌HN016免疫原混合液（2.0mL/只），保证每点注射量0.1~0.2mL。第1次免疫后，每隔3周加强免疫1次，（（2期罗伟等：无乳链球菌感染吉富品系尼罗罗非鱼的病理学研究
·377·其方法与第1次免疫相同，共免疫3次。免疫期间提供充足的饲料和水源。3次免疫结束后，于兔耳中动脉采血，血样先倾斜置于37℃培养箱中保存一段时间（不超过1h），再置于4℃冰箱过夜处理，然后在4℃下3500r/min离心30min，其上层血清即为免疫组化兔一抗血清，-80℃保存备用。1.5免疫组织化学观察
包埋好的组织切片经脱蜡、水化后进行抗原修改，采用三步法DAB显色（夏永娟等，2000；郭松林等，2011），经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后于显微镜下观察结果。
2结果与分析
2.1
病理形态学观察结果
病理组织切片观察发现，采用腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种感染方式均可使无乳链球菌侵入吉富品系尼罗罗非鱼体内。其中，腹腔注射和经口灌胃组的罗非鱼在感染2h后即出现病变，而体外浸泡感染方式出现病变的时间约在感染5h后，且病
变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻。人工
感染无乳链球菌后不同时间的吉富品系尼罗罗非鱼鳃、脾脏、肝脏及小肠组织病理变化如下：
鳃：腹腔注射组和经口灌胃组的吉富品系尼罗罗非鱼在感染2h后，其鳃组织均已出现明显病理变化（图1-A和图1-B），主要表现为基部上皮细胞增生，黏液细胞分泌亢奋，有炎症细胞浸润，部分鳃小片增粗，其呼吸上皮细胞和柱状支持细胞坏死、崩解，基部与鳃软骨呈水肿性离散；感染5h后，腹腔注射组和经口灌胃组均有罗非鱼表现出明显的临床症状，此时鳃组织病理变化十分严重，其基部上皮细胞大量增生，填满鳃小片间的间隙，大部分鳃小片的呼吸上皮细胞和柱状支持细胞坏死、崩解，黏液细胞分泌亢奋，有大量炎症细胞浸润（图1-C和图1-D）。体外浸泡组的吉富品系尼罗罗非鱼在感染5h后鳃组织才出现明显病理变化（图1-E和图1-F），表现为部分鳃小片呼吸上皮细胞和柱状支持细胞坏死、崩解，其基部与鳃软骨呈水肿性离散，上皮细胞大量增生，填满鳃小片间的间隙，鳃小片增粗。
ABCD图1Fig.1
EF人工感染无乳链球菌后吉富品系尼罗罗非鱼鳃组织的病理变化（×400倍）
PathologicalchangeofgillinGIFTtilapiaafterinoculationofS.agalactiae（×400times）
A：腹腔注射感染2h；B：经口灌胃感染2h；C：腹腔注射感染5h；D：经口灌胃感染5h；E、F：体外浸泡感染5h
A：2hafterintraperitonealinjectioninoculation；B：2haftergavageinoculation；C：5hafterintraperitonealinjectioninoculation；D：5hafter
gavageinoculation；E，F：5haftersoakinoculation
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