动物组织标本制作技术

动物组织标本制作技术

第一章：取材及固定 一、 动物致死法 1、麻醉法

第二章 可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或有盖玻璃瓶内进行麻醉；也可用4%戊巴比妥作静脉注射，剂量按动物体重1ml/kg；或用20%氨基甲酸乙脂作腹腔注射，剂量一般按动物体重5ml/kg。 2、空气栓塞法

如家兔可用50ml注射器将空气由耳静脉推入，使动物很快死亡。 3、击头法

如大、小鼠，可用重物击头后部或将其头后部猛撞桌沿，最好一击而死。 4、断头法

青蛙、小鼠等小动物，可用剪刀剪去其头部，较大动物如兔子等，可用斧头迅速砍头致死。 5、股动脉放血法

动物经吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。

注意：上述各法，应根据制片需要选用，如空气栓塞法不宜用作血管注射标本的制作；乙醚麻醉对丘脑下神经部分泌物染色标本不利；股动脉放血法有利于肠系膜铺片的制作。 二、 取材注意事项

1、材料新鲜

最好是动物心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内，脏器的上皮组织最易变质，应争取在死后半小时内处理完毕。 2、组织块力求小而薄

组织块的厚度以不超过5毫米为宜，较理想的厚度为2毫米左右，主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织块内部。 3、勿使组织块受挤压

切取组织块时刀剪要锋利，不要来回挫动，夹取组织时切勿猛压，取材时组织块可稍大，以便固定后修块。 4、尽量保持组织的原有形态

新鲜组织经固定后，或多或少产生收缩现象，为此可将组织展平，以尽可能维持原形。 5、要熟悉取材部位

要能准确的按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾部；肺应取有细支气管及带有软骨片的小支气管部。 6、动物品种的选择

如观察肥大细胞，以大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜铺片为佳，欲观察运动终板，可用小鼠的肋间肌等。 7、选好组织块的切面

熟悉某些器官组织成分安排，然后决定其切面的走向；如一长管状器官以横切面较好。

8、保持材料的清洁

组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。 9、切除不需要的部分

特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，否则给固定、脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。 三、 组织固定法 （一）、固定的方法

1、小块组织固定法：从人体和动物取下的小块组织，立即置入液态固定剂中进行固定，这是应用最广泛最经常的方法。

2、注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定。这时宜采用注射固定法，将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。 3、蒸汽固定法:比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。 （二）、固定的目的

1、迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使之尽量保持生前的状态与结构。 2、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持其原有状态。 3、使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以便染色后易于鉴别和观察。

4、使组织块在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易损坏。

5、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，经染色处理后易于辨认。 6、防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。

7、使组织块硬化，便于制作薄片。

（三）、注意事项及影响固定的因素

1、组织块不易过大，一般以厚度5mm，长宽不超过15×15mm。 2、固定液的量一般以组织块大小的20倍为宜。

3、必须选择渗透力强，又不使组织过渡收缩或膨胀的试剂作为固定液。

4、有的固定剂是由氧化剂与还原剂混合而成，如甲醛（还原剂）与重铬酸钾（氧化剂）混合成的Helly液等。 5、固定时间的长短视固定剂的不同要求而定，也与气温、组织块的大小有关。温度高时则时间缩短，组织块过大则应延长固定时间。

6、软组织或较大组织可先经2-3小时固定后再修整成小块重新投入新配制的固定液内继续固定。

7、特殊要求的组织，常需要特殊的固定液，所以，取组织之前应做好准备。如各种神经组织因显示内容不同，需不同的固定液与固定方法。 （四）、固定液

1、固定液种类：一类是单纯固定液，即只有一种试剂；另一类是混合固定液，由两种或两种以上试剂组成。 作为较好的固定液，应有下列特性，首先，有强渗透力，能迅速的渗入组织内部；其次，不使组织过渡收缩或膨胀，并能使组织内欲观察的成分得以凝固为不溶性物质；最后，能使组织达到一定的硬度并获得较佳的折光率和对某些染料具有较强的亲和力。 2、单纯固定液

（1）酒精：既是配制混合固定液的基本成分，又可作为单纯固定液使用。用于固定时以80%-95%浓度为好。缺点是经酒精固定的组织容易变硬，对组织收缩较大。

（2）甲醛水溶液：常用的甲醛水溶液即市售的福尔马林，常用浓度为10%，指以10ml的商品甲醛（37%-40%甲醛水溶液）加入90ml水配成的，此液实际上只有4%的甲醛。

（3）醋酸：亦名乙酸，能与酒精、水、氯仿等多种试剂混合，故为许多混合固定液成分之一，其穿透速度很快，固定小组织仅1h即可，对组织和细胞有膨胀作用，且不能凝固细胞质中的蛋白质，一般与引起收缩的固定液一起使用，以达到平衡目的。

（4）苦味酸：苦味酸能沉淀蛋白质，对脂肪、类脂无作用，渗透力较弱，很少单独使用，固定后收缩明显，用含苦味酸的固定液固定组织一般不宜超过24小时。

（5）重铬酸钾：其穿透速度快，对组织收缩小并稍有膨胀，重铬酸钾常备水溶液为3-5%。其混合固定液，如Zenker液、Helly液及Regaud液等被广泛用于组织学，凡经重铬酸钾、铬酸、铬酸盐固定的组织，必须以流水冲洗后方能转入脱水剂。

（6）锇酸：锇酸一般只用于某些特殊染色或电镜切片染色或固定，配制时要用洗涤干净的玻塞棕色瓶，最好用双蒸水配制，锇酸穿透力弱，且易使组织硬脆，因此它固定的组织必须小而薄，体积最好在3×3×2mm以内。 （7）铬酸：铬酸能沉淀蛋白质，适用于核蛋白的固定，并能增强核的染色能力，穿透速度慢，一般组织块的固定，需经12-24h，硬化程度中等，收缩显著，除用作固定液外，万分之一的铬酸水溶液，可制作分离标本。

（8）丙酮：丙酮能使蛋白质沉淀，渗透力强，但对核固定欠佳，且使组织剧烈收缩。广泛用于组织化学中酶的固定，其作用基本与酒精相同。

（9）三氯醋酸：作用与醋酸相似，很少单独使用，在混合固定液中对组织起膨胀作用。 3、常用混合固定液

（1）Bouin液：饱和苦味酸水溶液：75ml；甲醛水溶液（40%）：25ml；冰醋酸：5ml。三者在配方中的实际比例为1：5：15，为实验室常用固定剂，其渗透力强，对组织固定均匀且收缩较小，染色效果好。冰醋酸固定染色质，苦味酸使组织适当硬化，甲醛水溶液调节两种试剂对组织的膨胀作用。其固定时间以12-24h为宜。

（2）Carnoy液：冰醋酸一份，氯仿三份，无水酒精六份。此液浸透速度快，固定时间不宜过长，小块组织2-3小时即可，固定后直接入无水酒精脱水。常用于糖原及尼氏体固定。一般固定时须放在冰箱中，低温环境可明显减少收缩作用。 （3）中性甲醛液：最常用的固定液之一，配方:40%甲醛120ml,蒸馏水880ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠13g，pH7.0。 （4）中性缓冲甲醛液：为免疫组织化学最常用的固定液。固定时间24h为宜，配方：40%甲醛10ml，0.01mol/LpH7.4的PBS90ml

第二章：固定后处理及切片 一、 洗涤与修切 1、水洗法

一般常用流水冲洗，凡用含铬或锇的固定液固定的组织块，必须用流水冲洗24h左右。常用的固定液为10%的甲醛水溶液，也必须用流水冲洗，一般时间也为24h左右，固定时间长的标本，冲洗时间也应延长。

2、酒精洗涤法

凡含苦味酸或酒精的固定液固定的组织块，大多采用酒精洗涤，如苦味酸影响着色，但易溶于70%酒精。 三、 脱水与透明

（一）、脱水的意义与目的

组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水，脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。脱水时必须由低浓度脱水剂开始，逐步转入高浓度脱水剂，以防组织过度收缩而变形，或脱水不完全而影响制片效果。脱水剂必须具有下列特性:脱水剂能与水按比例混合；高浓度，一般指不含水分；脱水剂也能与透明剂混合。

1、脱水剂

（1）酒精：是最常用的脱水剂，脱水能力强，并能使组织硬化。其主要缺点是易使组织收缩、变脆，故应勿直接用高浓度酒精，一般从70%酒精开始；脱水时间勿过长。在70%可长时间保存。

（2）丙酮：脱水作用比酒精强，但对组织块的收缩较大，价格较高，主要用于快速脱水或固定兼脱水，脱水时间一般为1-3h左右。

（3）正丁醇和叔丁醇：正丁醇是无色液体，脱水能力较弱，可和水、酒精和石蜡互溶，因此这种脱水的组织块可直接浸蜡和包埋。叔丁醇是目前常用的一种脱水剂，它不易使组织收缩或变硬，且脱水后不经透明直接浸蜡，电镜标本制作时常用作中间脱水剂。

（4）其余脱水剂：还可以用作脱水剂的有：异丙醇、还氧己烷、四氢呋喃、环己酮和松脂醇等，但由于某些原因，现在都不常用。 2、透明或媒浸

（1）二甲苯：是最常用的常规透明剂，它对组织的收缩性强，易使组织变硬变脆，在二甲苯中一般30min即可使组织透明，组织块可先经过无水酒精-二甲苯混合液处理，再浸入二甲苯。也常用于切片染色后透明，且不会使染料退色。 （2）苯和甲苯：对组织收缩性较小，与二甲苯相比不易使组织变脆，但透明速度慢且挥发快，适用于处理致密结缔组织、肌肉及腺体等组织的透明。

（3）氯仿：不易使组织变硬变脆，但透明能力比二甲苯差，用作透明剂时，多用于大块组织的透明（1cm），而且在容器内放置无水硫酸铜。

（4）其他透明剂：四氯化碳、苯甲酸甲酯和水杨酸甲酯、香柏油（皮肤、子宫、肌肉和肌腱）、松油醇、丁香油、冬青油与苯胺油和火棉胶包埋的媒浸液等。 3、浸蜡

组织经透明后，在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56℃，在夏天较热时一般用高熔点石蜡，在冬天气温较低时用低熔点石蜡，主要是有利于切片的制作。时间不易过长，否则容易造成组织脆硬，时间不足，也难制作良好的切片。

四、 组织的包埋与包埋方法

组织块经过浸透剂浸透后，再用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋。不同的包埋方法有不同的要求，包埋后均可制成组织的块。经过包埋后，可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。 （一）、石蜡包埋法

石蜡包埋法为组织学技术中最常用的一种包埋法。石蜡具有不同的熔点，夏天一般用50℃以上熔点（硬蜡）石蜡包埋，冬天用50℃以下熔点（软蜡）石蜡包埋，软的组织用软蜡包埋，硬的组织用硬蜡包埋，一般常用的包埋熔点使52-56℃，如果需要切4微米以下的切片，则用56-60 ℃的石蜡，较厚的切片则用熔点为52-54℃的石蜡。新蜡必须在温箱内溶化一次，以使其所含的挥发性物质蒸发，无论新蜡和旧蜡都必须加热过滤后再包埋。 （二）、石蜡包埋法包埋过程

组织块透明后，即可放入已熔的石蜡内浸蜡；一般厚度约5mm的实质性器官，总的浸蜡时间约2-3h，均在恒温箱内进行。较理想的的浸蜡温度是石蜡刚溶化的温度，或在蜡杯底部尚残留一小部分未熔完蜡时的温度，浸蜡完成后，即做成包有组织的蜡块。包埋蜡块的器材有专用的包埋框，也有自己制作的包埋盒，只要是具有一定形状的容器，我们都可以把它用作包埋盒。包埋的具体过程详述。 （三）、其他包埋法

除上述常用包埋法以外，还有其他一些包埋方法，如塑料包埋法、碳蜡包埋法、明胶包埋法、松脂醇包埋法、甲基丙烯酸甲酯包埋法、双重包埋法及二甲氧基丙烷石蜡包埋法等。 （五）、火棉胶包埋法

火棉胶常用于大块组织的包埋。课避免纤维组织和肌肉组织的过度硬化，减少纤维组织的收缩和扭转，利于保

持原有的组织结构。

（六）、树脂包埋法

树脂包埋法适用于不脱钙骨髓活检组织，肝、肾穿刺活检和淋巴组织等，可观察细胞的细微结构。树脂选用亲水性甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯，组织不需脱水，对细胞形态影响轻。 五、 切片

石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介制作切片的。

切片前的处理：

A:修切蜡块： 切片前应先修块，即切去组织周围过多的石蜡，一般留下至少约2mm宽度的蜡边为宜。注意蜡块不能留得太窄，在切片时易损坏组织；蜡边不能留得太多，否则影响展片。室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。 B:切片用品准备

（1）切片刀：预先磨好切片刀备用或切片前更换 新的一次性切片，切片刀对组织块的倾角非常重要，一般在10°以内，过小则组织块不能先与刀刃的刀口接触，过大时，使刀口刮组织蜡块表面，切片易碎。 （2）载物片：载物片经清洁液、95%乙醇处理后备用。 （3）展片仪：加入温水，接通电源，调整温度

（4）其他用品：准备好毛笔、记号笔、镊子、等。 六、 粘片

粘片的目的是将石蜡切片粘附在载玻片上，借水的张力和一定的温度，使略皱的蜡片伸展平整，以便染色和镜检。 粘片有两种方式：水捞法——将一个盛水的容器加热至35-40°，将蜡带光泽面向下铺于温水上，待蜡片伸展平整后，即可用长镊子分离每一个蜡片，再用载玻片伸入水中，从蜡片下面捞起，直立玻片使水流掉并置温箱内烘干。

干粘法——可将已经切离的蜡片单个的放在加有数滴蒸馏水的载玻片上，然后在酒精灯上摇晃烘烤，此时应注意控制水的温度勿使过高，待蜡片平整后，倾去玻片上的水，用细针调正蜡片的位置，继续在酒精灯上烘烤至蜡片呈半透明状为止，以后在温箱内烘干即可。当蜡片已放在有水的载玻片上后，可不经酒精灯烘烤，而在调好温度的电热板上烘烤。

第三章：染料、常用染液及常规苏木素-伊红染色法 一、 染料性质

二、染色原理：

嗜碱性：细胞和组织中的酸性物质或结构（嗜碱性物质）与碱性染料亲和力强。 嗜酸性：细胞和组织中的碱性物质或结构（嗜酸性物质）与酸性染料亲和力强。 中性：与两种染料的亲和力均不强。

在组织染色中所谓的“嗜酸性”及“嗜碱性”一词，是说该物质易被酸性或碱性染料所染，而细胞本身的酸性或碱性正与其相反。

三、常用染液及染色法： 1、细胞核常用染色法 A：苏木精-苏木精是从苏木用乙醚连续提取的淡黄色或棕黄色结晶，溶于酒精，甘油及热水中。苏木精不能单独使用，主要是对组织的亲和力小，欲使其成为一种染料，必须在苏木精溶液中加入复盐和氧化剂。配制苏木精的常用氧化剂有过锰酸钾、氧化汞、碘酸钠及过氧化氢等，或将配置好的苏木精在空气中自然氧化，所以放置时间较长的苏木精染液染色效果较好。

B：硫堇或甲苯胺蓝染色法-切片入1%硫堇或甲苯胺蓝水溶液染12-24h，然后95%酒精分色，结果：核蓝色，粘液，软骨基质，肥大细胞颗粒呈蓝紫色。

C：碱性品红-碱性品红对显示多数糖类及弹性纤维效果良好，也可显示核酸。作为细胞核的一般染色，可用0.5-1%水溶液染色数分钟。

D：媒染染料细胞核染色法-指在配制染料时需加入一些媒染剂如氯化铝，铝矾等类似的复盐才易着色。如天青石蓝B染色法：天青石蓝B0.1克，铁矾5克，蒸馏水100ml，混合后煮沸数分钟，冷后过滤，切片染2-3分钟，此液可代替苏木精染细胞核。

2、细胞质常用染色法

A：伊红-伊红种类很多，但常用为伊红B和伊红Y。同时一般均配成0.5-1%水溶液或酒精溶液，在染蓝色核后，经伊红复染，最后用95%酒精分色。

B：酸性品红-酸性品红常用于结缔组织染色，染色后色泽鲜艳，缺点是易于退色，不易长久保持。