始思索从头测序的新技术。最近，Balagurusamy等实验展示了两个连续12聚体的双链通过氮化硅膜上的纳米孔的位移过程，并对其成功进行了电子检测。另一项的固态纳米孔研究报道了与肽核苷酸探针（PNA）杂交的双链DNA线性通过一个30nm厚的膜上的纳米孔的过程（亚5纳米）。这些研究有望实现经纳米孔的杂交测序(Sequencing by Hybridization,SBH)，也被称为杂交辅助纳米孔测序法（Hybridization -assisted Nanopore Sequencing, HANS）。NABsys公司已为这项技术申请到许可，这是一家由布朗大学物理教授Sean Ling 2005年创办的DNA测序新创公司。该公司旨在开发\电子阅读\计算芯片并商业化。实际中观测到，6聚体的杂交探针可与长100千碱基的基因组片段结合，在电泳中驱动基因组片段通过固态纳米孔并产生电流信号（图7D）。基于电流追踪、探针定位，于是，小片段序列就可以被测定。如果以一个完整的探针文库来平行地进行这个测序过程，那么就能基本上做到对全基因组的阅读和组装。该公司承诺全基因组测序成本最终会降低4个数量级。但是，如何以杂交辅助纳米孔测序法（HANS）技术达到对电子信号阅读的足够的分辨率，仍是一个有待探讨的问题。 长距离阅读DNA的扩展方法
目前大部分的DNA测序技术都是依赖于对小于400个碱基的DNA片段的短读取方法。目前有几种不同的新方法，它们着眼于对长达百万碱基的DNA片段进行测序。最近一些报道都强调了在对原核生物的基因组拼接中短读取技术的局限性。对长DNA区域进行绘图，可以提供重复、缺失、插入、转位的数据，但这些却是现有短读长测序方法不能做到的。
通过光学绘图来做最后组装威斯康星大学麦迪逊分校David C. Schwartz教授及其同事开发了仅有的一套系统(光学绘图，Optical Mapping)，可以用于数据策略指导、验证、完整复杂基因组的组装。光学绘图系统以大量的数据库材料，包括一些由5,000-2,000,000 个基因组DNA分子（长约50千碱基）的数据组，构建了覆盖全基因组范围的长距离的有序的限制性图谱，并以酶切点为\条形码\，直接用荧光显微镜成像。这种高度自动化系统是第一个具备全基因组分析能力的单分子平台。光学绘图系统拥有善于做序列比对排列的计算工具，可以在全基因组范围内将新发现的序列整合到从头测序的图谱中。除了可以精确描述染色体数目和大小外，这种序列比对排列还能定位孤儿序列，为序列支架和重叠序列排出次序和方向，能确定出基因组中序列缺口大小，揭示出组装错误。光学绘图系统早期应用都集中在细菌和低等真核生物基因组；而最近，光图谱分析已成功地指导复杂基因组的组装和验证，包括大米和玉米。因为很大基因组DNA（约500 KB）的得到了分析，那些近着丝粒的复杂基因组区域，或有很多重复片段就能够得到测定，这样就能揭示出新的结构变异（这是测序所不能企及的）。这一技术优势使得很多新的结构变异得以发现，例如人类基因组的插入或复杂重排。这些结构变异曾在人类基因组测序中令人困惑，并呼唤新方法的出现，以解决如癌症基因组的断裂点和重排等问题。
Schwartz实验室则开发出更为先进的基因作图方法，通过增加测序读数到长的双链分子，并且开发了Nanocoding系统。在一个独立的反应混合物中，他们将待测的基因组片段，用具有打口功能的限制性酶在同源识别位点处选择性地剪切
双链DNA中的一条链。新产生的缺口被贴上用荧光染料标记的核苷酸。这样就有了独特的单分子条码，因为最终产物是全长双链DNA，它的每个酶识别位点以荧光修饰。修饰好的DNA分子被放入微流体芯片，然后进入宽50 微米的通道。这些微流体通道以45的角度一分为二成为宽1微米深100 纳米的纳米流体通道。微流体-纳米流体通道的角度，加上纳米流体通道的宽度，显着降低了使DNA分子由盘绕形式充分伸展开来所需的熵值惩罚，而低离子强度缓冲也又大大促进了分子在纳米孔内的伸展。一旦DNA分子链在通道充分伸展开来，荧光成像系统[FRET (荧光共振能量转移系统，Fluorescence Resonance Energy transfer， FRET)和机器视觉就会识别以共价键形式掺入的荧光基团在DNA分子链上位置，继而这些数据被组装到全基因组范围的物理图谱中。
第二个应用纳米流体学的公司是BioNanomatrix，其技术已由普林斯顿大学获得许可证。他们也使用纳米流体通道将DNA伸展开，靠的是一种经独特加工的通道入口设计。这个通道的宽度和深度都是大约100nm或稍小。为了是DNA链克服熵障碍而进入通道，他们将通道深度由微米变成纳米，使DNA逐渐解旋并进入纳米通道以进行拍照。这些芯片中可能设有狭窄部分，可以迫使DNA链穿过紧窄空隙。BioNanomatrix芯片中使用甲酰胺和受控的局部加热（在荧光基团供体YOYO-1存在时），使DNA发生部分变性，然后从荧光信号的模式上来推断DNA序列。第二种技术被用于在λ-DNA上识别地标。研究者们用缺口酶去置换限制性酶识别位点核苷酸，然后，将被置换链与荧光标签探针进行杂交，再以一个摄像头和图像处理软件进行分析。他们在30秒内照了300 DNA分子，在2个目标位点上，85%的DNA分析得到了正确标记。
非光学的DNA分子伸展方法这里讨论的方法仍然是在某种表面上将DNA进行伸展，再去读取每一个碱基。但这种方法完全无需使用照相机，而是使用原子成像方法。Halcyon分子（HalcyonMolecular）是依靠快速扫描隧道电子显微镜
（Rapid-scan Tunneling Electron Microscope，TEM）方法的第四代技术。单个DNA碱基都被标以独特的重原子，使它们得以彼此区分开来。ZS遗传公司（ZS Genetics，ZS指的是零科学）使用TEM方法，但还没有发表任何详细的方法和结果。据报道，使用扫描隧道显微镜能（STM）可将鸟嘌呤同非鸟嘌呤进行区别。STM测量流经扫描头的电子密度。尽管能读取140bp并且能够同参照基因组序列进行比对，但是一些局限性尤其是测序速度，阻碍了其商业应用的可行性。 结论
在新型DNA测序技术领域里，各种技术和资助以从未有过的速度在增长。如本综述中所言，出现了很多不同的方法，横跨不同代的新技术。每种技术都有自身的优势和局限，因此，从根本上说，要做特定目的的基因分析应用，必须进行合理评估，以选择合适的测序平台。虽然第二代和第三代平台有很大的通量，但基于桑格原理的毛细管电泳测序仍是超高精度测序的黄金标准，是迄今为止唯一既能为人类基因组既提供从头测序和又有从头组装技术的技术。下一代测序技术为了获得广泛认同，无论是第二或第三代平台中的哪一种，都必须也同时具备一套第一代毛细管电泳测序平台，并同时将由着两套平台得到的从头测序样品的测序结果和组装结果进行定量比较，方能使人放心而得到广泛的认同---换言之，
无论第二，三代测序平台怎样发展，它们仍然依赖于第一代平台的协助作用。这将为从头测序的真实成本提供坚实的证据，并作为一个出发点，供现在和将来的研究人员去决定如何解决下一波的人类基因组测序计划，或对决定如何开展对一些相似的复杂基因组进行从头测序。目前，既然现有的测序技术局各有其局限性，为了达到对一种复杂的全基因组进行从头测序，可能需要随机采用几种技术，彼此协调配合，以达到测序的高通量，准确性、高读长的相邻重叠片段、和大范围的基因绘图。(生物谷Bioon.com)
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