课 时 教 案
讲 授 人 课题内容 教学方法 教学手段 查幸福 课 时 3 教学时间 教学课型 板书、多媒体 1 了解突变的种类和产生的因素 2 理解DNA复制忠实性的机制 3 掌握DNA修复的机制 4 掌握DNA重组的方式及原理 序 号 2007.09.28 理论□ 实验□ 习题□ 实践□ 复习□ 其它□ 6 DNA damage, repair and recombination 讲授 教学目的 重点难点 DNA突变、修复、重组 教 学 内 容 F1 诱变 突变 指DNA碱基序列发生的永久的可遗传的改变。一个单一碱基的改变为点突变，它包括转换（嘌呤与嘌呤，嘧啶与嘧啶间的互换）或颠换（嘌呤与嘧啶间的互换）。如果点突变发生在DNA的非编码区、非调节区或密码子的第3个碱基，它不会影响渗入蛋白质中的氨基酸，为沉默突变；如果发生氨基酸的改变，则为错义突变。形成新的终止密码的突变为无义突变，产生截短的蛋白质产物。一个或多个碱基的增加或丢失，会引起移码突变。群体中许多沉默突变及非致死性突变的积累会产生遗传多态性。 复制忠实性 复制的精确性有3种机制：互补碱基配对原则（模板链和进入核苷酸在DNA聚合酶的作用位点正确配对）；聚合酶的3/→5/外切酶活性有校对功能，它能回走从3/端切掉错配核苷酸，引物是DNA聚合酶发挥自我校正功能的必要条件；逃脱校对的错误可被错配修复机制所纠正。 诱变剂 常见的物理诱变剂为紫外线，它引起相邻嘧啶核苷酸产生嘧啶二聚体。化学诱变剂种类很多，碱基类似物可改变碱基配对特性，诱发直接突变（如5—溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的类似物）。亚硝酸使胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，引起复制中A—T向G—C转化。烷化剂能在DNA不同位置加上烷基，造成碱基脱落，经修复才能防止DNA损伤，细胞对损伤的处理有可能会由于间接诱变而导致突变。 直接诱变和间接诱变 DNA中存在稳定的、配对特性发生改变的碱基而导致的突变为直接诱变；在有些情况下，一些损伤DNA聚合酶为了保证染色体的完整性在损伤对应的位点上插入错误的碱基，导致间接诱变；突变发生在损伤的位点上为定点突变，发生在其它位点为非定点突变。原核生物中转移损伤DNA合成属于对DNA损伤的SOS反应（有时也叫“易错修复”） F2 DNA损伤 碱基的损伤和丢失 DNA的一些损伤是自发的，如胞嘧啶会自发水解脱氨变为尿嘧啶，它会在接下来的复制中与腺嘌呤配对。生理温度下，哺乳动物的基因组每天约失去10000嘌呤和几百个嘧啶。许多已改变的碱基会被专一性的DNA糖基备 注 化酶所除去，形成无嘌呤和无嘧啶位点或AP位点。 氧化性损伤 自由基可攻击DNA，产生氧化产物造成氧化损伤 烷基化 烷化剂为亲电化学试剂，可将烷基加到核酸的各种位点，导致DNA损伤。有些是致死性的，多数导致间接诱变损伤。 聚化加合物 紫外线使相邻嘧啶，尤其是胸腺嘧啶形成环丁烷嘧啶二聚体；煤焦油中的苯并芘在肝脏产生的一种产物可与鸟嘌呤残基共价结合；芳香族烷化剂、黄曲霉毒素B1均可与DNA共价结合。 F3 DNA修复 光复活 DNA中的嘧啶二聚体可通过可见光的光解作用而恢复为单体，催化此过程的酶是DNA光解酶（光复活酶）。E.coli的光解酶有两个发色团：蝶呤和FAD。这是一种无差错的“直接修复”。 烷基转移酶 该酶可直接从突变的O6—烷基鸟嘌呤上除去烷基，酶作用后即失活。它也属于无差错直接修复。 切除修复 为普遍的无差错的修复机制。有两种形式：核苷酸切除修复（如E.coli中的UvrABC内切核酸酶识别并切除嘧啶二聚体和其他大块损伤，缺口可由DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补）；碱基切除修复（专一的DNA糖基化酶识别修饰碱基，切除修饰碱基与糖基间的N—糖苷键，留下一个脱嘌呤或脱嘧啶的AP位点，AP内切核酸酶在该位点切开DNA。 错配修复 是一种特殊的切除修复，它是按模板的遗传信息来修复错配碱基的，因此修复时首先要区别模板链和新合成的DNA链。它通过碱基的甲基化来实现的。大肠杆菌DNA的5/—GATC序列中A的N6都是甲基化的（Dam甲基化酶负责），复制后的一个短暂时间内，新合成链的GATC中的A 未被甲基化，故子代DNA暂时是半甲基化的，这是识别的基础。错配的碱基被MutS和 MutL组合的复合体识别并与之结合，再与 MutH内切核酸酶结合，后者在子代链GATC附近的位点上产生缺刻，启动对损伤区的切除修复。遗传性非息肉结肠癌就是一种错配修复酶突变丢失引起的。 着色性干皮病（XP）患者缺乏对紫外线引起的大块DNA损伤的切除功能，对阳光极度敏感，易患皮肤癌 F4 重组 同源重组 也称一般重组，即两个双螺旋DNA分子间同源序列进行交换。双倍体真核生物发生在减数分裂过程，非姐妹染色单体交换相对应的区域，产生的单倍体配子会包含父母本两方的遗传信息。单倍体细菌也可重组，如发生在部分已复制DNA间或染色体DNA与外源DNA（质粒或噬菌体）间。重组的过程和机制包括断裂—复合、异源双链、分支迁移、Holliday结构、拆分（见教材P98图）。大肠杆菌的核酸酶和RecBCD结合在 chi序列上并产生切口形成单链末端，单链DNA被 RecA蛋白包裹，4条单链形成Holliday结构。同源重组对DNA修复也很重要（复制后修复或重组修复）。 位点特异性重组 非同源DNA的特异片段间的交换，它是在结合序列部位由特异的酶来催化断裂重接，而同源重组则是由能与RecA蛋白结合的DNA序列随机断裂引发的。λ噬菌体可将自身基因组插入大肠杆菌染色体的特定位点，噬菌体编码的整合酶与细菌编码的整合宿主因子（IHF）促成重组结果和λDNA进入宿主染色体。λ噬菌体编码的切除酶被激活时，整合作用发生逆转，λ—DNA脱离细菌基因组。在真核生物中，免疫球蛋白有3个基因段编码重链和轻链的可变区：V、D和J。这些基因段间的重组产生大量的不同重链和轻链基因序列，导致抗体种类的多样化。 转座作用 又称非常重组，一些短的DNA片段（转座子或转座元件）可转 移进基因组的几乎任何位置。转座子均有两个结构特征：两端有20~40bp的反向重复序列；具有编码转座酶的基因，该酶催化转座子插入新的位置。E.coli中的IS元件（插入序列）是最为简单的转座子。Tn转座子系列除了转座酶，还携带其它基因（如抗性基因），其中的β—内酰胺酶可使生物体抗青霉素。酵母中的Ty元件编码的蛋白与反转录病毒的反转录酶和整合酶相似，Ty元件两侧为长末端重复序列，它先转录成RNA再反转录到DNA双螺旋中，然后插入到其它地方，果蝇的copia转座子与其相似，称为反转录转座子。高等真核生物中的一些分散重复序列（如LINES和SINES）很可能是通过转座作用在基因组内传播的。 思 考 题 与 作 业 教学后记
DNA修复有哪些类型?机制各是什么? DNA修复机理用模型来讲解会清楚一些。
课 时 教 案
讲 授 人 课题内容 教学方法 教学手段 查幸福 课 时 3 教学时间 教学课型 板书、多媒体 1 了解DNA克隆及常用宿主和载体 2 掌握基因组文库和cDNA文库 3 掌握DNA克隆的一般步骤 序 号 2007.10.05 理论□ 实验□ 习题□ 实践□ 复习□ 其它□ 7 Gene manipulation 讲授 教学目的 重点难点 DNA克隆策略及其基本方法 教 学 内 容 G1 DNA克隆概述 DNA克隆 将生物体基因组DNA片段作为自主复制载体的一部分进行独立复制，对其进行分离和操作即为DNA克隆。基因组的较小片段连接到一段可以自主复制的DNA（载体）上，形成重组DNA，带有重组DNA的宿主细胞增殖构成一群具有遗传一致性的个体为单克隆。 宿主和载体 载体应具有整合特性、独立复制特性和易被筛选的选择标志，常用的载体有细菌质粒、噬菌体（λ噬菌体和噬菌体M13）和一些病毒，还有人工改造的载体如黏粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体等。常用宿主有大肠杆菌和酵母菌。 亚克隆 将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体转移的过程为亚克隆 。它可用来对较大的克隆片段上的较短区段进行仔细研究。 DNA文库 是一套DNA克隆，它是带有不同DNA片段的载体在宿主中扩增后的产物。由基因组DNA构建的为基因组文库，由细胞mRNA经反转录合成的cDNA插入载体构成cDNA文库。 筛选含有目的基因的克隆通常用DNA探针经杂交来测出，并用限制性酶切图谱来分析DNA片段。 G2 质粒DNA的制备 质粒载体 大肠杆菌的质粒是染色体外的环状DNA，有复制起点（ori ），能独立复制，含有抗生素抗性基因（bla 或ampr 基因—抗青霉素，tetA基因—抗四环素）。是常用的载体。 质粒的制备 碱裂解法最常用：菌体沉淀悬浮于缓冲液中，加入含有SDS的氢氧化钠溶液使DNA变性RNA水解，再用高浓度pH5的乙酸钾沉淀变性蛋白质和染色体DNA，离心，上清中含质粒DNA。用酚抽提法除去残余蛋白，留在水相中的DNA和RNA可由乙醇沉淀得浓缩并用核糖核酸酶A降解残余RNA。也可用氯化铯密度梯度离心纯化，这是获的极纯的超螺旋质粒DNA的最佳方法。 备 注
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