I3 筛选流程 筛选 用核酸探针杂交。制作探针的方法常用聚合酶链反应（PCR）制成PCR探针。将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其置入含放射性标志探针溶液中保温，检出相应克隆。 表达筛选 通过抗体筛选来检测cDNA编码的蛋白质 杂交扣留和释放 cDNA与mRNA杂交后可抑制某些mRNA的翻译（杂交扣留翻译）。杂交的mRNA被纯化后进行翻译（杂交释放翻译）可鉴定cDNA克隆编码的蛋白 染色体步移 从文库中分离相邻基因组的克隆来克隆目的基因为染色体步移。 思 考 题 与 作 业 教学后记
什么是基因组文库？主要流程有哪些步骤？ 文库的构建是本节课的中心内容。
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讲 授 人 课题内容 教学方法 教学手段 查幸福 课 时 3 教学时间 序 号 10 2007.10.26 理论□ 实验□ 习题□ 实践□ 复习□ 其它□ Analysis and uses of cloned DNA 讲授 教学课型 板书、多媒体 1 了解核酸测序的基本方法 2 了解限制图谱，序列分析，基因组测序计划 3 理解PCR反应的原理及操作 4 掌握克隆技术的应用 教学目的 重点难点 克隆的鉴定、核酸测序、聚合酶链式反应 教 学 内 容 J1 克隆的鉴定（一般了解） J2 核酸测序 DNA 测序 有Maxam 和Gilbert的化学法及Sanger的酶学法 RNA 测序 用能切割3/ 端特异核苷酸的RNase来酶解具5/ 端标记的RNA进行序列测定。 测定的DNA或RNA序列均输入序列数据库（如EMBL和Genbank），还要用计算机对序列进行分析检索，找出其特征。 基因组测序计划 测定某种生物基因组的全部序列。如人类基因组测序基本完成。大部分人类基因组测序使用的是BAC克隆。 J3 聚合酶链式反应 PCR 利用与DNA 模板两端互补的一对引物来扩增一段DNA的过程为聚合酶链反应（PCR） PCR循环 目的DNA加热至950C变性分为两条链，当降温至550C，引物与模板退火，再升温至720C进行聚合反应（消耗dNTP 和Mg2+ ），对目标分子不断拷贝，直至温度再次升到950C，变性、退火、聚合不断循环，使分子数目迅速增长。通常循环20~40次 已知一些序列信息从而能设计出引物的DNA都能应用于PCR。引物通常为18~30个核苷酸，如果克隆一个只知道部分氨基酸序列的蛋白质的cDNA，可利用遗传密码的简并性设计简并引物，这种应用简并寡核苷酸引物的PCR有时也叫DOP—PCR；从嗜热菌中分离的热稳定的DNA聚合酶被用于PCR，常用Taq聚合酶。PCR还有一些派生技术。 备 注 J4 克隆基因的组构 以寡聚dT为引物合成的cDNA通常在3/ 端有poly(A)标志来推导出编码区。基因组克隆中基因的存在和极性不明显，可通过作图和杂交实验来确定 J5 克隆基因的诱变 缺失诱变 从一端逐渐删除DNA以确定特定序列的特性为缺失诱变。对于cDNA克隆通常从编码区一端删除，产生N端或C端截短的蛋白；基因组克隆逐步删除起始点上游的序列以发现具有启动子和调控功能的最短上游序列。外切核酸酶Ⅲ 可从凹进的3/端沿3/至5/方向移去一条链形成单向缺失，再用 S1或绿豆核酸酶除去突出部分形成平末端进行连接，经转化产生缺失的克隆。 定点诱变 改变序列中特定核苷酸的诱变 PCR诱变 J6 克隆技术的应用 包括重组蛋白的生产、遗传修饰生物体的构建、DNA指纹分析、诊断试剂盒及基因治疗 思 考 题 与 作 业 教学后记
什么是PCR？如何鉴定阳性克隆？ PCR在日常生活中的应用更能表明分子生物学对我们的深刻影响。
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讲 授 人 课题内容 教学方法 教学手段 何宁佳 课 时 3 教学时间 教学课型 板书、多媒体 序 号 11 2007.11.02 理论□ 实验□ 习题□ 实践□ 复习□ 其它□ Transcription in prokaryotes 讲授 教学目的 1 掌握原核生物RNA聚合酶的结构。 2 理解大肠杆菌ζ因子尤其是ζ70的功能和识别序列。 3 详细介绍原核生物转录起始、延伸和终止三大过程以及所涉及到的重要分子的作用机制。 大肠杆菌RNA聚合酶的结构；mRNA 合成时的方向和正反义链的区分、大肠杆菌σ启动子，及其启动效率的理解；以及原核生物RNA合成过程。 70重点难点 教 学 内 容 K1 Basic principles of transcription (转录的基本原则) 转录概述 以DNA 为模板合成RNA的过程为转录，它由RNA聚合酶催化ATP、GTP、UTP、CTP4种原料沿5’→3’方向合成。DNA上通常只有一条链会转录成RNA，为有义链；另一条链为反义链，也叫模板链。 起始 RNA聚合酶结合在双链DNA的启动子部位，该部位双螺旋解旋，聚合酶从起始位点起始RNA的合成，该位点被定义为基因序列的+1位置。 延伸 聚合酶沿5’→3’方向延伸RNA链。 终止 发生在终止子处，该序列含有自身互补区，能在RNA产物上形成茎环或发夹结构从而终止转录。 K2 Escherichia coli RNA polymerases (大肠杆菌RNA聚合酶) 大肠杆菌RNA聚合酶 有5个亚基组成：α、β、β’、ω、ζ亚基；全酶包括α2ββ’ ωζ，转录开始后ζ因子从转录复合物上释放下来，剩下的酶（核心酶）沿DNA链移动。α亚基无转录功能，但对核心酶的组装是必需的，β亚基是酶的催化中心，受利福平抑制。β’亚基结合了两个Zn2+，可能负责酶与模板的结合，肝素能与该亚基结合，ζ因子以δ70最常见，在识别启动子中起关键作用，对转录延伸不重要。 K3 The E. coliζ70 promoter (大肠杆菌ζ70启动子) 由40~60bp序列组成，-55—+20的区域被聚合酶结合，在-10和-35位置的两个6bp序列尤为重要 -10序列 是位于转录起始位点-10位置的保守序列（共有序列为TATAAT），又称Pribnow框，可能与解旋有关。在-35位置还有一段保守序列（共有序列为TTGACA），与ζ因子组成识别区。 起始点 90%的基因转录起始点是嘌呤，G比A更重要。 影响启动子的效率的因素包括-35、-10区域，起始位点附近的序列等。 备 注
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