DNA的粗提取与鉴定
【复习目标】
1．通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质。 2．理解DNA粗提取与鉴定的原理 【基础知识】
一、提取DNA的方法
提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 1.DNA的溶解性
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。 ①在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？
②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
此外，DNA不溶于 溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。 2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
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蛋白酶能水解 ，但是对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80C的高温，而DNA在 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 ，但对DNA没有影响。3.DNA的鉴定
在 条件下，DNA遇 会被染成 色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 二、实验设计
1．实验材料的选取：
凡是含有 的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量较高的生物组织，成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料（2~3种）： 鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌 思考：哺乳动物的红细胞的特点？
2．破碎细胞，获取含DNA的滤液：
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的 ，
同时用 搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用 溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的 和 ，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
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思考：①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ ②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响? ④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 3．去除滤液中的杂质： 基本原理 DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在 的NaCl溶液中的溶解度最低 DNA不被蛋白酶水解 DNA不溶于酒精溶液 加入嫩肉粉 加入冷却的体积溶于NaCl溶液中并稀释 方法 目的 ①NaCl溶液浓度为2 mol/L时，DNA溶解，部分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质； ②当NaCl溶液稀释至0.14 mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶于NaCl中的部分蛋白质和其他杂质 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，可水解蛋白质 析出DNA，除去溶于酒精的蛋白质 分数为95%酒精 4．DNA的析出与鉴定： 将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积 、冷却的 ，静置2~3min，溶液中会出现 色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿 方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为 的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的 。混合均匀后，将试管置于 中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变 。 三、操作提示
1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止 。 2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免 ，导致DNA分子不能
3.形成絮状沉淀。二苯胺试剂要 ，否则会影响鉴定的效果。 四、实验步骤 （一）、植物DNA的粗提取和鉴定
1．取材: 称取30g的菜花，去梗、切碎。
2．研磨: 将切碎的菜花放入研钵中，加入洗涤剂和食盐，充分研磨搅拌。 3．过滤: 在漏斗中放上纱布，进行过滤。 4．去除滤液中的杂质： 第二次过滤：在滤液中加入2mol/L的
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NaCl， 。
第三次过滤：沿烧杯壁加蒸馏水使NaCl的浓度为0．14mol/L时，析出DNA，用纱布过滤。
第四次过滤：将纱布中的DNA溶于2mol/L的NaCl，用二层纱布过滤，去除杂质。 5．沉淀： 在一倍体积的上清液中倒入体积相等的冷却的酒精，溶液中析出白色丝状物。
冷酒精的作用：①抑制核酸水解酶的活性，防止DNA水解。 ②降低分子运动，使DNA易于析出。
③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。 6．鉴定：
取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物溶于其中一支试管中，然后向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂，混合均匀，沸水浴加热，待冷却后，比较两支试管的颜色变化。 （二）、动物DNA的粗提取和鉴定 1．材料制备：
0.1G/ml柠檬酸钠100ml 500ml烧杯→玻璃棒搅拌→离心2min→吸去上清液→
活鸡血180ml 即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天
使鸡血细胞自行沉淀）
2．方法步骤：
取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌 （1）提取血细胞核物质 纱布过滤，滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质
原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂
（2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌
（3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，
出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液相当于稀释到0．14mol/L）
（4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上 （5）（纱布上的）DNA粘稠物再溶解： 20ml 2mol/LNaCl溶液 50ml烧杯， 上述粘稠物 缓慢搅拌3 min （6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA
（7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋95%酒精，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用
玻璃棒将丝装物卷起。
（8）DNA鉴定：
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【习题巩固】 1．在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中分别使用2mol／L、0．14mol／L、2mol／L、0015mol／L的氯化钠溶液，其作用分别是（ ）
A．溶解、析出、溶解、溶解 C．溶解、溶解、析出、溶解 B．析出、溶解、析出、溶解 D．溶解、析出、溶解、析出
2．在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品的浓度和名称分别是（ ）
①0．1 g/ml的柠檬酸钠溶液 ②2．00mol/L的NaCl溶液 ③0．14 mol/L的NaCl溶液 ④体积分数为95%的酒精溶液 ⑤0．015 mol/L的NaCl溶液 ⑥0．04 mol/L的NaCl溶液
A．①③⑤ B．③④ C．②④ D．②③④ 3．与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（ ） A．操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度
B．在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 C．加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出 D．当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度约为0.14mol/L. 4．（多选）下列有关“DNA粗提取”的操作中，正确的是（ ） A．在鸡血细胞液中加入蒸馏水
B．在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加入蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多 C．在用酒精凝集DNA时，要使用冷酒精 D．玻璃棒搅拌时随意使用 5．“DNA的粗提取与鉴定实验”中有三次过滤： （1）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液。（2）过滤含粘稠物的0.14mol/L NaCl . （3）过滤溶解有DNA的2mol/L NaCl. 以上三次过滤分别为了获得（ ） A．含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液 B．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液 C．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布中DNA D．含较纯的DNA滤液、纱布上粘稠物、含DNA的滤液
6．为获取较纯净的DNA，采集来的血样可用蛋白酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。下列有关叙述，正确的是（ ）
A．除去血浆中的蛋白质 B．除去染色体上的蛋白质
C．除去血细胞表面的蛋白质 D．除去血细胞中所有的蛋白质
7．在“DNA的粗提取与鉴定实验”中，和“使用蛋白酶从染色体中提取DNA”中的蛋白
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