项目二十二 变态反应的检验技术

项目二十二 变态反应的检验技术 一 变态反应的类型及检验原则

变态反应（allergy）是由免疫炎症或其他免疫应答机制所致的组织损伤或功能障碍，也称为超敏反应（hypersensitivity）。诱发变态反应的抗原称为变应原，可以是完全抗原，也可以是半抗原；可以是外来抗原，也可以是自身抗原。自身抗原引起的病理状态又称自身免疫病。

按照发生机制的不同，变态反应可分为4型（表16-1）。

表16-1 变态反应的分类比较

型别 Ⅰ型 别名 发生机制 主要相关疾病 支气管哮喘、药物过敏荨麻诊、过敏性鼻炎、过敏性休克等 新生儿溶血症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜等 血清病、皮肤血管炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等 接触性皮炎、移植排斥反应、结核病等 即刻型、反应素型、过IgE/肥大细胞和嗜碱性粒细胞介导的敏反应 血管和平滑骨反应 Ⅱ型 细胞毒型，细胞结合抗IgG，IgM/补体或粒细胞介导的靶细胞原型 溶解和吞噬等 Ⅲ型 免疫复合物型 迟发型（细胞介导型）超敏反应 免疫复合物/补体介导的组织炎症 Ⅳ型 TH细胞介导的浸润性炎症 （一）Ⅰ型变态反应

诱导Ⅰ型变态反应的抗原多是外源性的，例如花粉、尘螨、青霉素、食品等，可经呼吸道、消化道或皮肤等途径进入机体，刺激机体产生IgE或IgG4，结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞上，使宿主进入致敏状态。变应原再次进入机体时，可与细胞表面的IgE或IgG4结合，诱导细胞脱颗粒，释放炎症介质，引起一定部位的血管和平滑肌反应。相关疾病有：支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性胃炎、荨麻疹、过敏性休克等。Ⅰ型变态反应发生迅速，临床常见的严重病例是青霉素引起的过敏性休克，如不及时抢救患者会很快死亡。但型变态反应一般不引起组织损伤，所以刺激因素解除后康复也快。

Ⅰ型变态反应的检验有多种方法：①皮肤试验，例如青霉素皮试；②激发试验，例如支气管激发试验；③血清IgE测定。Ⅰ型变态反应的临床诊断并不困难，实验室检查的主要目是明确过敏原，以采取适当的回避措施，或者必要时进行特异性脱敏治疗。 （二）Ⅱ型变态反应

Ⅱ型变态反应涉及的抗原比较复杂，药物、病毒或自身抗原都可成为变应原，刺激机体产生IgG或IgM类抗体，抗体可特异性地结合到位于细胞表面的抗原上，活化补体、溶解靶细胞、诱导粒细胞浸润及吞噬作用。涉及的疾病有新生儿溶血症、自身免疫性血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、部分肾小球肾炎、肺出血－肾炎综合征等。 少数情况下，某些抗体与靶细胞结合可刺激靶细胞兴奋，导致非常特殊的效果。例如抗体促甲状腺素受体的抗体可使甲状腺细胞过度分泌甲状腺素而引起甲状腺功能亢进；有些抗体诱导ADCC作用引起慢性淋巴细胞性甲状腺素等。这两型特殊的Ⅱ型变态反应曾被命名为Ⅴ型和Ⅵ型变态反应。

Ⅱ型变态反应的检验主要是针对引起反应的特异性抗体；但Ⅱ型变态反应主要涉及血液系统疾病和自身免疫病，有关内容参见血液学检验教材和本书第二十五章。 （三）Ⅲ型变态反应

Ⅲ型变态反应的抗原多是蛋白质分子，刺激机体产生大量IgG和IgM类循环抗体，抗原与抗体结合形成的免疫复合物（immunecomplex，IC）在一定条件下可沉淀于局部组织，激活补体引起炎症反应。涉及的疾病有血清病、结缔细胞病及局部Arthus反应等。 Ⅲ型变态反应的检验主要是检测循环免疫复合物或组织固定的免疫复合物；还可进一步检测免疫复合物中的抗体特异性；有时候也可用皮肤试验进行测定。 （四）Ⅳ型变态反应

Ⅳ型变态反应是细胞免疫介导的炎症，没有抗体和补体参与，发生较为缓慢，所以又称为迟发型超敏反应（DTH）。涉及的疾病有接触性皮炎、结核病、移植排斥性反应等。

Ⅳ型变态反应的检验可从多方面进行。要以用促有丝分裂原或结核菌素检测T细胞的敏感状态；也可用抗原检测机体的特异性致敏状态；还可通过检测细胞因子或者皮肤试验的办法进行检验。

二 动物实验性过敏反应

豚鼠过敏反应

(Anaphylactic hypersensitivity of guinea-pig)

【实验原理】

豚鼠过敏反应属于Ⅰ型变态反应。先给动物注射小剂量异种蛋白，经过一定的潜伏期，动物处于致敏状态。当第二次用较大剂量的相同抗原注射时，即激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒释放多种生物活性介质，使动物迅速产生严重的过敏反应及至过敏性休克或死亡。 【试剂和器材】

1．动物 体重200g左右的健康豚鼠。 2．马血清、鸡蛋清。

3．无菌注射器、针头、酒精棉球等。 【步骤和方法】

1．取豚鼠2只，经腹腔或皮下注射10%马血清(用生理盐水稀释)0.1ml。

2．2~3周后，在上述2只豚鼠心脏内注射，一只注射马血清原液(不稀释)，另一只注射鸡蛋清，各2ml。

3．注射后数分钟内密切观察其反应现象。 【结果判定】

注射马血清的豚鼠出现烦躁不安、抓鼻、耸毛、咳嗽、打喷嚏、气急、呼吸困难、痉挛性跳跃、大小便失禁、站立不稳等现象，重者在数分钟内死亡。将死亡豚鼠解剖，可见肺脏极度气肿，胀满整个胸腔。由于动物个体反应性不同，有的反应较轻，可幸免死亡。如果再注射马血清也不出现反应，此称为脱敏状态。但脱敏状态是暂时的，大约2周后又处于致敏状态。

注射鸡蛋清的豚鼠不出现任何反应。 【注意事项】

心脏内注射时，要固定好动物，以免划破心脏；当见到注射器内有回血时再注入抗原。 【方法评价】

豚鼠过敏试验是一个经典的动物过敏性休克试验，方法简单、重复性较好、稳定、过敏现象明显。

【临床意义】

豚鼠过敏反应现象与人类过敏性休克反应相似。通过试验加深学生对Ⅰ型变态反应现象及发病机理的理解，提高对人类过敏反应防治重要性的认识。另外，也可用于抗过敏药物的筛选。

【思考题】

1．上述试验的两只豚鼠为什么会出现完全不同的反应现象？ 2．Ⅰ型变态反应是如何发生的？

四 血清总IgE的测定——ELISA双抗体夹心法

(Total serum IgE assay)

【实验原理】

将特异性羊抗人IgE抗体包被固相载体，然后与待检血清中IgE结合，洗涤后再加入酶标羊抗人IgE抗体，经洗涤，加底物显色，其吸光度值与样品中IgE含量成正比。待检血清IgE的含量可从标准IgE测定制作的标准曲线上查得。 【试剂和器材】 1．标本 待检血清

2．羊抗人IgE纯化抗体(包被用)。

3．羊抗人IgE-HRP 用方阵滴定法确定最适浓度。

4．IgE标准参考品 混合人血清，经WHO国际IgE标准参考品标定IgE含量。 5．底物缓冲液 取0.1mol/L Na2HPO4·12H2O(35.8g/L) 5.14ml、0.05mol/L柠檬酸(10.5g/L) 4.86ml，混匀，加入邻苯二胺(OPD)4mg，置棕色小瓶中，临用时加30% H2O2 4.0μl，混匀。 6．包被液 pH9.5 0.05mol/L CB (Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g、NaN3 0.2g，加蒸馏水

至1000ml)。

7．稀释液 pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(Tris 2.42g、1mol/L HCl 13ml，加蒸馏水至1000ml)。

8．洗涤液 含0.1% Tween-20的pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液。 9．终止液 2mol/L H2SO4。

10．器材 温箱(或水浴箱)、酶标测定仪、酶标反应板、微量加样器、小吸头等。 【步骤和方法】

1．包被 将羊抗人IgE纯化抗体用包被液稀释成10μg/ml，加到酶标反应板各孔中，每孔200μl，加盖放4℃ 24h。次日用洗涤液洗涤3次，每次3min(下同)。甩干。

2．加样 A排孔依次加入连续倍比稀释的IgE标准参考品200μl(浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05IU/ml)。B排孔依次加入1:10、1:100的待检血清200μl，各设两个复孔。同时设阴性、阳性血清对照，各加200μl；空白对照加入稀释液200μl。加盖置37℃ 2h。洗涤，甩干。

3．加酶标抗体 每孔加已稀释的羊抗人IgE-HRP 200μl，加盖置37℃2h。洗涤，甩干。 4．加底物 每孔加底物液200μl，置37℃暗处20min。 5．终止反应 每孔加终止液50μl。

6．测定结果 测定各孔A492值。

2.01.5吸光度1.00.50.10.20.40.6124610204060100

IgE含量(IU/ml)

图4-1 IgE标准曲线

【结果判定】

以标准参考品IgE含量(IU/ml)为横对数坐标，以各浓度的A值为纵算术坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线(图4-1)。由标准曲线查出样品中IgE的相对含量，再乘以稀释倍数，即为样品中IgE的含量。IgE 1 IU=2.4ng 参考值范围： 男 631±128 IU/ml (31~5535ng/ml) 女 337±60 IU/ml (31~2000ng/ml) 【注意事项】

1．本法的灵敏度为0.2IU/ml，最敏感且呈线性关系的范围是3.13~50IU/ml，如所测结果不在此范围内，可增减浓度后再行测定，以求得准确结果。

2．包被用羊抗人IgE抗体、待检血清稀释度、羊抗人IgE-HRP浓度及温育时间均可影响本法结果，故需选择其最适条件。

3．其它注意事项参见ELISA间接法。 【方法评价】