分光光度计的原理与使用

分光光度计的原理与使用

一、目的要求：

1、学会紫外-可见分光光度计的原理和使用方法 2、学会测量溶液的浓度。 二、实验原理：

1、分光光度计原理：分光光度计是目前化验室中使用比较广泛的一种分析仪器，其测定原理是利用物质对光的选择性吸收特性，以较纯的单色光作为入射光，测定物质对光的吸收，从而确定溶液中物质的含量。其特点是灵敏度高；准确度高；测量范围广；在一定条件下，可同时测定水样中两种或两种以上的物质组分含量等。

分光光度计按其波长范围可分为可见分光光度计（工作范围360～800nm）、紫外-可见分光光度计（工作范围200～1000nm）和红外分光光度计（工作范围760～400000nm）等。

2、在日常使用及维护当中应注意以下几点： 第一，在使用仪器前，必须仔细阅读其使用说明书。

第二，若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新调零及满度后，再测量。

第三，指针式仪器在未接通电源时，电表的指针必须位于零刻度上。若不是这种情况，需进行机械调零。

第四，操作人员不应轻易触动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率。 第五，放大器灵敏度换挡后，必须重新调零。

第六，比色皿使用时要注意其方向性，并应配套使用，以延长其使用寿命。新的比色皿使用前必须进行配对选择，测定其相对厚度，互相偏差不得超过2%透光度，否则影响测定结果。使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净（测定有色溶液后，应先用相应的溶剂或（1+3）的硝酸进行浸泡，浸泡时间不宜过长，再用蒸馏水冲洗干净），并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。

第七，比色皿架及比色皿在使用中的正确到位问题。首先，应保证比色皿不倾斜。因为稍许倾斜，就会使参比样品与待测样品的吸收光径长度不一致，还有可能使入射光不能全部通过样品池，导致测试准确度不符合要求。其次，应保证每次测试时，比色皿架推拉到位。若不到位，将影响到测试值的重复性或准确度。

第八，干燥剂的使用问题。干燥剂失效将会导致以下问题：①数显不稳，无法调零或满度。②反射镜发霉或沾污，影响光效率，杂散光增加。因此分光光度计应放置在远离水池等湿度大的地方，并且干燥剂应定期更换或烘烤。

第九，分光光度计的放置位置应符合以下条件：避免阳光直射；避免强电场；避免与较大功率的电器设备共电；避开腐蚀性气体等。 3、吸光光度法测定溶液浓度原理

基于物质对不同波长的光波具有选择性吸收的能力而建立起来的分析方法。 （1） 光线：

光线的波长： 200nm-400nm 紫外线，400-750nm可见光， >750nm 红外线 光具有波粒二相性，波长不同，其能量不同。 （2） 物质的吸收光谱及颜色：

A． 物质的原子吸收光谱和原子发射光谱：原子的最外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为激发态而产生的光谱称为原子吸收光谱。激发态原子恢复到基态，则释放出特征波长的光子，形成原子发射光谱。不同的溶液其光谱不同，即不同溶液对不同波长的光其吸收能力不同，对某一特定波长的光存在吸收峰。 B． 可见光由赤橙黄绿青兰紫等能量不同的光线组成，当可见光穿过某一溶液时，由于特定波长的光被吸收而使溶液呈现相应的颜色。（如CuSO4由于吸收了可见光中的黄光(600nm)而成蓝色）不同颜色的溶液对不同波长的光其吸收能力不同。 （3） 光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）：

一束平行单色光（Io）通过有色的透明溶液时，一部分的光可以透过溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,还有一部分被器皿表面反射（Ir）,则： Io=It+Ia+Ir 。那么，该溶液透光率为: T = It / Io 。

1． Lambert 定律：设有一束平行单色光,通过液层厚度为b 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力: A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k2b

k2 为吸光系数，为常数。与入射光波长、溶液性质、浓度和温度有关；A 为吸光度（又称光密度O.D 或消光度E），当入射光波长、吸光溶液的浓度和温度一定时，A 与b 成正比。

2． Beer 定律：设有一束平行单色光,通过浓度为c 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:

A=lg(Io/It)=Ig(1/T)=k4c

k2 为常数。由Beer 定律可知：当入射光波长、吸光溶液的厚度和温度一定时，A 与c 成正比。

3． Lambert-Beer 定律：综合1.2.得： A=Kbc ,

即：当入射光波长、吸光溶液的性质和温度一定时，A 与b、c 成正比。 （4） 吸光光度法的基本原理：

1、 不同物质，由于其分子结构和原子组成不同，故对光的吸收光谱不同（如：CuSO4），在测定不同颜色的物质浓度时要用最大吸收的波长的入射光，这样测量的灵敏度最高。

2、 同一种物质，若浓度不同，则对同一波长的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比关系。

3、 应此，利用特定波长的单色光（通常用最大吸收波长的入射光）照射不同浓度的某一溶液时，所得的吸光度大小应与溶液浓度呈线性关系，故可利用该线性关系通过计算或查标准曲线来求得未知溶液的浓度。 （5） 吸光光度法特点：

1． 灵敏度高：mg%级、甚至ug%级。 2． 准确度高：误差2-5%

3． 操作简便、快速，仪器设备不复杂，价格低廉，故应用广泛。 三、实验器材： UV2000分光光度计 四 、实验步骤

（一） UV2000 型分光光度计的使用及注意事项 1、 插上插头，接通电源，打开暗箱盖，预热20min。

* 注意：分光光度计在接通电源而不用时，必须打开暗箱盖，以免光电管老化。

2、 将准备好的试剂倒入比色杯中，用吸水纸擦去比色杯外侧水珠，并依次放入比色杯架中。

* 注意：手拿比色杯毛面，试剂倒入杯中满2/3 即可，不得将比色杯放在仪器上。

3、 调节所需波长，选择功能至“T”。 4、 调“0”：放入挡光板，按调“0”键调节。

5、 调“100%”：取出挡光板，盖上暗箱盖，调“100%”，让光线通过“空白管”。 6、 重复调“0”和调“100%”数次。

7、 将选择键由“T”调至“A”，此时读数应由“100”至“0”，若不为“0”，可用“0%”键调节。

8、 拉动拉杆，分别读取“A 标”和“A 样”。 9、 取出比色杯，弃去溶液，洗净晾干，备用。 （二） 计算

1．利用标准管计算测定物含量： A 样=K 样b 样c 样 A 标=K 标b 标c 标

因为入射光的波长，溶液性质和温度以及比色杯的 厚度都一样，即：K 样=K 标 b 样=b 标 所以：A 样/ A 标= c 样/ c 标 得：c 样= c 标×A 样/ A 标 2． 利用标准曲线进行计算： 3． 偏离Lambert-Beer 定律的原因 1） 由于非但色光引起的偏离。 2） 由于溶液本身原因引起的偏离： ① 由于介质不均匀引起的偏离 ② 由于溶液中化学反应引起的偏离 （三）CuSO4 浓度的测定 比色波长=650nm

按上述操作步骤测定硫酸铜溶液A 样和A 标，按下式计算样品浓度：

C 样 = C 标 * A 样 / A 标 五、结果与思考

1、如果用标准曲线法测定硫酸铜溶液浓度，该如何设计实验？ 2、分光光度计的维护要注意什么？ 3、比较各种分光光度计的使用范围。