SDS-PAGE电泳
蛋白质的分子量大小不同来分离蛋白质混合物的，(蛋白质携带的电荷、蛋白质的分子形状、凝胶内的电场分布等因素的影响)
分辨率不高，在电泳胶上看到的一条带中，往往多于一个蛋白质，甚至一条带中有多达10种蛋白质分子。使表达量低的蛋白质被掩盖在高表达量的蛋白质的电泳斑中。反相层析柱的分辨率高一些，能够分离提纯出更低浓度的蛋白质，在SDS-PAGE电泳的一条带的样品中，可能在反相层析柱特别是HPLC的反相层析柱有时可能不是一个洗脱峰。所以在用反相层析柱分离蛋白质后，应该适当浓缩目的蛋白质样品后再上SDS-PAGE电泳。
另外，反相层析柱分离出的是疏水性较强的蛋白质，所以在SDS-PAGE电泳处理时应该适当加入上样液中适当的表面活性剂增溶，并且事先要去掉层析柱的洗脱液。
SDS-PAGE电泳中根本没有带出现目的蛋白质的相对分子量对应的条带原因和解决方法（没有弥散带出现、简版）
1.分离胶的浓度不合适，需要重新配胶。处理办法：降低分离胶的浓度，一般不要升高分离胶浓度，要不然会缩小分离被分离的蛋白质的Mr范围。可以分梯度进行，如果这一步无效，那么考虑因素2和3。 聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分离范围的关系： 聚丙烯酰胺凝胶浓度（%T） 蛋白质分离范围/kd 5 36—200 6 30—200 8 20—175 10 15—150 12 10—100 15 6—50
浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。可能是蛋白质相对分子量超出了分离胶分离的范围而无法或者很难通过分离胶，或者说目的蛋白质在分离胶里走不动了。
2.改变分离胶和电泳缓冲溶液的pH，分离胶的pH一般可以为8.8-9.2。
3.样品可能上样量太少了，使得考马斯亮蓝无法有效染色。每个加样孔的最低蛋白质的质量是：0.1μg（考马斯亮蓝染色），2ng（银染）。但是每一个点样孔的蛋白质的加样量不要一般大于20μg，最多不能超过40μg.
4.样品未能充分溶解。可以适当加大样品缓冲溶液的浓度，比如使用（2-5）X样品缓冲溶液。 2X样品缓冲溶液制备：
2X sample buffer solution: combine 5ml Stacking gel buffer solution (Stacking gel buffer solution: dissolve 15.2 g Tris base in 200 ml water, adjust to pH 6.8 by slow addition of concentrated HCl, add water to 250 ml final volume),8ml 10% SDS solution ,and 1ml water. Add 4ml glycerol,2 ml 2-mercaptoethanol and mix well (preferably in fume-hood). Add a small amount(1-2 mg) of bromphenol blue indicator dye. Divide the sample buffer 1ml portions(plastic screw cap vials are preferable) and store at -70℃(or -20℃ for short periods).Note: the solution may require warming to dissolve crystallized SDS.
——from: Creighton-Protein Structure------A practical approach, LCL Press,1997,8,10.
一般使用时需要把2X sample buffer solution稀释一倍之后使用，如果真的要用5X sample buffer solution，建议溴酚蓝指示剂染料（bromphenol blue indicator dye）适当减少一些。
国内有蛋白质实验指导书一开始就直接用5X样品缓冲溶液加入样品蛋白质，然后沸水浴，这样可能影响实验结果，因为高浓度的SDS会干扰考马斯亮蓝染色，过多溴酚蓝指示剂染料（bromphenol blue indicator dye）也可能引起蛋白质的电泳的条带
异常。如果样品缓冲溶液浓度较大，建议染色时加入戊二醛使得考马斯亮蓝染色效率会大大提高。
如果使用样品缓冲溶液可能会出现不溶性颗粒，宜用电磁搅拌子温和搅拌使其充分溶解，然后再进行沸水浴变性。用电磁搅拌子温和搅拌使其充分溶解无效，可以在沸水浴变性5-10分钟再看，还是不溶解，那就过滤去除。
5.沸水浴变性5-10分钟之后的蛋白质样品，在上样前还要离心操作，并且去除掉不溶性颗粒。
6.在考马斯亮蓝染色时，可以考虑加入戊二醛使得考马斯亮蓝染色效率会大大提高。 使用步骤是，在染色时将凝胶移入50%的甲醛和10%醋酸缓冲溶液混合的容器内，瀙泡至少1h，期间换液2-3次；而后在通风柜中用10%的戊二醛瀙泡或冲洗0.5 h，其实就是轻轻震荡一下，让戊二醛充分穿透凝胶使得蛋白质分子之间发生交联，然后用蒸馏水连续清洗2h，如此处理，考马斯亮蓝染色效率会大大提高。
7.融合蛋白质表达时可能是由于含有的目的蛋白质融合蛋白质的氨基酸序列变大，而且蛋白质在细胞里是边翻译边折叠，可能引起了一些异常的折叠，尤其是在大肠杆菌细胞里，外源蛋白质如果表达多而快，往往还会形成不溶解的包涵体，即使不形成包涵体而形成分泌蛋白质，融合蛋白质的折叠结构往往也与天然游离的蛋白质不同。所以在样品上样前的煮沸阶段和SDS变性和溶解都不同，一般1克蛋白质结合1.4克SDS，操作时SDS用量可以稍大些。
其实楼主要鉴定反相层析柱分离的蛋白质样品的纯度，用质谱测定相对分子量最为精确和直接且方便。
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