20 25 30 35 40 45 0.256 0.234 0.213 0.192 0.170 0.149 70 75 80 85 90 95 100 0.042 0.021 -0.0009 -0.022 -0.044 -0.065 -0.086
各级分蛋白质含量的测定
采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。标准蛋白的取样量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml，用去离子水补足到1.0ml。
柱级分IV酶活力的测定
计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表：
为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。
（一）.实验数据记录及处理：
级分 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 1. 酶的纯化表如下：
记录体积(ml) 19.2 17.0 30.8 3.5 蛋白质 总蛋白(mg/ml) (mg) 17.1 3.6 1.81 6.38 412,46 245.85 105.08 13.57 Units/ml 79 85 总 Units 1279.8 1033.2 比活 Units/mg 2.89 4.20 5.16 7.50 纯化倍数 回收率% 1.0 1.1 1.3 1.8 92,43 90.47 78.37 54.86 101.5 542.3 120.5 647.5 ［注］：一个酶活力单位Units，是在给定的实验条件下，每分钟能催化1?mol蔗糖水解所需的酶量。
2.各级份蔗糖酶活性测定：
管数
酶液0.5ml
乙酸缓冲液(0.2mol/L pH4.9)
H2O（ml）
蔗糖0.05M (ml) 旋光值α
转化率（%）
转化率（%）X15000?MX0.01L
1.5 5
I II 1.5 5
III 1.5 5
IV 1.5 5
3 0.335 0.763 114.45
3 3 3 0.116 0.286 -0.141 0.786 117.9
0.768 0.813 115.2 121.95
3．各级份蛋白含量的计算：
蛋白质浓度（μg/ml）
级分 A280 稀释倍数 蛋白浓度 0.90.850.8吸光度值A595粗级分Ⅰ 1.34 10 0.891 热级分Ⅱ 0.804 10 0.211 醇级分Ⅲ 0.688 10 0.059 柱级分Ⅳ 0.663 10 0.026 0.750.70.650.60.550.500.050.10.150.20.250.3蛋白浓度（mg/ml）y = 0.7664x + 0.6427R2 = 0.8679
4．酶活力的鉴定：
粗级分Ⅰ 热级分Ⅱ 醇级分Ⅲ 柱级分Ⅳ 原始酶液体积E’ (μE’ (μE’ (μE’ (μA650 A650 A650 A650 （ml） mol/min.ml) mol/min.ml) mol/min.ml) mol/min.ml) 0.50
0.335 79 / / 0.286 85 0.116 / 101.5 / -0.141 / 121.5 / 5.校正体积计算：
级分 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 记录体积ml 19.2 17.0 30.8 3.5 核正体积计算 19.2 11.4×（19.2／13.7） 30.8×（19.2／13.7）×（11.4／9.9） 3.5×（19.2／13.7）×（11.4／9.9）×（30.80／3.5） 取样体积ml 校正后体积ml 1.5 1.5 1.5 —— 19.2 16.0 49.6 6.38
6.离子交换层析洗脱液浓度曲线如下：
7. 尿糖试纸测酶活性实验结果如下：
试管① + 试管② ++ 试管③ +++ 试管④ + （二）结果讨论和实验心得：
误差分析：（1）研磨不够充分，离心后管中脂肪层很薄。 （2）测量体积时可能会出现读书误差。
（3）在测定吸光值时，需先将分光光度计打开预热，目的是稳定它的波长；因为测量数据是分两步进行的，所以最好用同一台仪器测定。
4）使用紫外分光仪测蛋白含量时，换样时比色皿清洗不干净或比色皿中残留蒸馏水较多，使待测样品更加稀释。
讨论与心得：
（1）严谨的实验态度和小组间的团队合作是十分重要的.
（2）实验室一定要注意控制反应的温度和时间,以免影响反应结果.
（3）本实验对蔗糖酶进行初步纯化的两次蛋白质沉淀的原理是不一样的.第一次是蛋白质在高温下进行变质失活,第二次是在有机溶剂中沉淀蛋白质保持活性,蛋白质保持原有构型和活性.因此,蔗糖酶比较耐高温,可以在50摄氏度保持活性.因此,蔗糖酶在纯化过程中不会有太大损失,但在离心等过程中,为了尽可能的保持蔗糖酶的活性还是要在低温中进行(如放入冰箱保持应有温度)
（4）在进行离心操作前,要先对两支离心管进行平衡,(要盖上离心管的盖子,因为不同盖子的质量也是不一样的,离心管对称着放)避免离心过程中产生较大噪音而损坏离心机.
（5）本实验在干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了细胞破碎技术和离心技术.
实验中极大的培养了我认真做事的态度以及团队协作的能力。在实验中，我们遇到不会不懂的，及时与老师沟通和同组成员探讨，认真、谨慎、积极，比较成功的完成了此次是实验。
我掌握了酵母细胞的破碎，离心，蛋白质的沉淀等技术，见到了许多仪器（例如旋光仪，可见光分光光度计，离心机，分析天平等），并且亲自操作并掌握了使用方法，了解它们的工作原理。实验主要培养我们的我们的动手能力，在此次实验中我得到了充分的验证。我相信在以后的实验中，我们的会合作的更好。在下次大实验中表现得更好，向着自己的理想迈近一步，认真踏实的完成每一步实验，希望自己能在生物工程领域中能有更好地发展！
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