高效毛细管电泳指纹图谱在中药研究中的应用

高效毛细管电泳指纹图谱在中药研究中的应用

摘要：以中药指纹图谱质量控制特征为基础,综述了毛细管电泳在中药指纹图谱方面应用的基础理论和方法。介绍了毛细管电泳指纹图谱的优势,毛细管电泳指纹图谱的研究方法与评价方法及其在中药质量控制中的应用。 关键词：毛细管电泳；指纹图谱；毛细管电泳-质谱联用；中药；应用

The application of capillary electrophoresis fingerprints of

traditional Chinese medicines

Abstract:To review the basic theories and methods of capillary electrophoresis fingerprint (CEFP) of traditional Chinese medicines based on quality controlled characteristics of traditional Chinese medicine fingerprint. The advantages of CEFP were introduced, and the research and appraisal method of CEFP for traditional Chinese medicine were also discussed.

Key words: capillary electrophoresis (CE); chromatographic fingerprints; capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS); traditionalChinese medicines (TCMs); application

任何药物都必须安全、有效。随着中药在世界各地的影响和应用日益广泛,人们对中药的安全性、有效性、稳定性提出了更高的要求,但中药的质量控制一直是制约中药现代化与出口的“瓶颈”。在我国,众多的科研工作者致力于中药质量控制方法的研究,其中色谱法的应用取得了可喜的成绩[1,2]。仅以《中华人民共和国药典》2005版一部[3]为例,用薄层色谱法(TLC)鉴别的品种达1523项,用于含量测定的45项;用高效液相色谱法(HPLC)测含量的品种达479种,涉及518项;用气相色谱法(GC)鉴别和进行含量测定的有47种。与2000版中国药典比较,采用TLC,HPLC及GC鉴别的品种分别大幅度增加了866,413及37项。可见色谱法在中药质量控制中应用之广泛。虽然中药的质量控制有了很大的进步,但由于中药的成分极其复杂,中成药则尤甚,更由于其疗效是基于中药物质群的整体作用,因此对少数成分的定性、定量,不足以代表中药质量的总体表征。在这种情况下,中

药指纹图谱应运而生。 1.高效毛细管电泳 1．1高效毛细管电泳概述

高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis,HPCE），是以高压电场为驱动力，以毛细管作为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术。CE仪器基本结构大致包括毛细管柱、进样系统、高压系统、检测系统和数据采集系统等。毛细管柱是CE的核心部件，石英毛细管是当今的首选材料。最常用的毛细管内径为（20～75)cm，有效长度为(50～75)cm。进样系统采用自动进样方式，主要有流体力学和电动方式，高压系统要能提供130 kV的直流电压。检测器目前最常用的是紫外—可见光检测器和荧光检测器等。CE作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术，自上世纪80年代问世以来，得到了迅速的发展，其研究和应用涉及环境分析、药物分离、生化分析等几乎所有的分析领域，引起学术届，尤其是色谱界的广泛关注。这与它独特的优点是密不可分的:(1)分离时间短。由于毛细管具有良好的散热功能，分离毛细管的纵向电场强度可达到400V/cm以上，因而分离操作可以在很短的时间内(最快可在几秒钟)完成。(2)具有很高的分离效率。理论塔板数达到400,000/m以上，最高达10,000,000/m数量级。(3)仪器结构简单，操作简便，运行成本低，且易实现自动化。(4)样品用量极少(仅为纳升级)，绝对检测限较低。

1.2 毛细管电泳法发展的历程

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE),或称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是在毛细管中(内径≤100μm,常用75μm),在电场作用下带电质点(离子或胶粒)在电解质溶液中,向电荷相反的电极以不同速度迁移而分离的现象称为毛细管电泳法。1981年Jorgenson和Luckacs[4]首次使用内径75μm的石英毛细管和30 kV的高电压,获得了高于40万理论塔板数的分离柱效,标志着CE技术的诞生,这就是目前广泛应用的毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis, CZE)。1984年Terabe, Otsuka和Ichikawa[5]等发展了基于组分疏水性差异而实现分离的毛细管胶束电动色谱(micellar elec-trokinetic capillary chromatography, MECC )。1969年,Vesterberg[6]合成了一种

经随机聚合产生的多氨基和多羧基的混合物,即载体两性电解质,可用其分离等电点差异达0.01 pH的蛋白质。1985年Hjerten和Zhu[7]将该法引入毛细管电泳中,发展了基于等电点不同而分离的毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing, CIEF),它结合了常规等电聚焦电泳(IEF)的高分离能力和现代毛细管电泳的特点,使其成为分离蛋白质的重要方法之一。1987年Cohen和Karger[8]提出了基于分子量大小筛分机制的毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis, CGE)。1981年Jorgenson和Luckacs[9]在170μm内径的毛细管中填充了10μm的Partisil ODS-2,在电场作用下成功地分离了9-甲基蒽和芘，获得了3·1万理论塔板数的柱效,并指出在以电渗流作推动力的情况下,固定相的填充不规则性对样品区带展宽并不重要，这种技术被称为电色谱(capillary electrochroma tography, CEC)。电色谱在90年代得到了迅速发展,是毛细管电泳与色谱法相结合的产物,具有电场力与液压2种驱动力,是被认为最有前途的新分析方法。它是在毛细管中填充或毛细管壁涂布、键合色谱固定相，依靠电渗流及液压推动流动相，使中性的和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间分配系数不同而实现分离的一种电分离模式。1990年瑞士Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer首次提出微全分析系统( Miniaturized total chemical analysis system,μ-TAS )的概念和设计[9-11],自此微型化、集成化和自动化的芯片毛细管电泳技术获得了重要发展。 1.3 基本原理和分析特点

HPCE是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间的淌度和分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术。仪器装置通常包括高压电源、进样系统、毛细管柱、检测器和记录系统5部分,其中毛细管柱是分离的核心部分。研究与实践表明,HPCE与高效液相色谱(HPLC)相比具有以下特点:(1)分离效率高,理论塔板数高达106~107/m;(2)分析速度快,一般在20~30 min内可完成一次电泳操作;(3)应用模式多样,已经发展了毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动毛细管色谱(MECC)等分离模式,扩大了HPCE的应用范围;(4)样品用量少,仅为纳升级;(5)灵敏度高,用激光诱导荧光检测器可达10-24的超低检出限。 2. 中药指纹图谱概述

中药指纹图谱[12,13]是基于总体识别中药的观念,以系统的化学成分结合药理学研究为基础,采用一定的分析手段,将中药的药效和化学成分的相关性以图谱的

形式描绘出来,以鉴别真伪,辨认优劣。以往分析工作者力求运用各种分析检测手段测定某种有效成分,以某一活性成分含量的多少来判断某种药材及制剂的质量。这样的分析方法有两个主要缺点:一是有效成分不一定是该种药材药效的专属成分;二是不符合中医理论,尤其在复方制剂中,任何一种活性成分均不能反映中医用药所体现的整体疗效,分析的越细,目标越缩小,离中药的整体疗效的距离越远。因此,凭借某一种化学成分定性和定量的中药质量评价方法的有效性和专属性逐渐受到质疑。在不可能将中药复杂成分完全搞清楚的情况下,指纹图谱是总体反映药材及其制剂内在质量和稳定性的可行手段。国际上,如美国食品药品管理局(FDA)、世界卫生组织(WHO)、欧洲共同体、印度和加拿大草药典等对草药产品的质量评价也提倡采用指纹图谱[13,14]。

指纹图谱不要求呈现在图谱中的每一个组分的化学结构都清楚,也不要求对每个组分都精确定量,但要求图谱具备指纹特征,即专属、稳定、实用,凭借指纹图谱可确认产品的真伪,且能判断质量稳定与否[15]。现代分析仪器的发展已可提供用于指纹图谱分析的强有力技术,特别是色谱和毛细管电泳这样的分离分析方法及其与质谱的联用技术,可以提供多维的数据。比如采用毛细管柱GC或顶空气相色谱(HSGC)可以获得中药中可挥发性成分的谱图[16];采用裂解气相色谱(Py-GC)可以获得药物成分降解产物的信息[17];采用HPLC[18,19]则可以获得中药中难挥发和不挥发成分的谱图。毛细管电泳(CE)由于分离效率高,适用样品范围广,分析成本低而得到广泛的应用,在中药指纹图谱研究中已有不少报道[20],比如,十大功劳药材[21]和栀子药材[22]的CE指纹图谱等。然而,必须承认,中药指纹图谱的研究才刚刚起步。由于指纹图谱分析是一项极为复杂的系统工程,原料药材和成药的组成和疗效又受许多因素的影响,故要将色谱或CE指纹图谱作为普适而有效的质量标准尚有很多必须解决的问题。如原料药材的质量稳定性和投料物的选择、用于不同药材和制剂的指纹图谱分析的技术确定和方法验证、数据处理的规范和图谱解析标准[23]、优良实验室规范(GLP)、优良制造规范(GMP)和整个分析方法的自动化问题等等,均需要做全面而系统的研究。 3．毛细管电泳指纹图谱的优势

毛细管电泳以简捷的技术提供了较高的可靠性,样品不需要特殊处理;试剂消耗量极少,极大地降低购买和处理的费用;纳升级进样量可使有限的样品得以被充