如绿色荧光蛋白(GFP)的应用
激光共焦扫描显微镜技术
（Laser Scanning Confocal Microscopy） ?原理 ?应用：
?相差显微镜（phase-contrast microscope）
将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞
?微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器
?录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动
电镜与光镜的比较 主要电镜制样技术
? 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 ?负染色技术（Negative staining）与金属投影
染色背景，衬托出样品的精细结构
?冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） ?电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology） ——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。
扫描电镜
?原理与应用：
?电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。 ? CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题
排除焦平面以外光的干扰，增强
图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，
可重构样品的三维结构。
一、 离心分离技术
?用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物
?差速离心：分离密度不同的细胞组分
?密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法
?原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。
Feulgen Staining 三、特异蛋白抗原的定位与定性 ?免疫酶标技术
?免疫胶体金?免疫荧光技术：
快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图） ?蛋白电泳(SDS-PAGE)
与免疫印迹反应(Western-Blot) ?免疫电镜技术： ?免疫铁蛋白技术 技术
应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等
四、细胞内特异核酸的定位与定性
?光镜水平的原位杂交技术
（同位素标记或荧光素标记的探针）
?电镜水平的原位杂交技术
（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）
?PCR技术
五、放射自显影技术
?原理及应用：
?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； ?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 ?步骤：
?前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）
———放射自显影
六．定量细胞化学分析技术
? 细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry） ?利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。
包括：
紫外光显微分光光度测定法
可见光显微分光光度测定法 ? 流式细胞仪（Flow Cytometry） ?主要应用：
用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；
测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。
一、细胞的培养
?动物细胞培养 ? 类型：原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell）
? 细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制 ? 细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失 ?植物细胞 ?类型： 原生质体培养 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养） ? 非细胞体系（cell-free system）
二、细胞工程
?细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 ?单克隆抗体（monoclone antibody）技术 图 ?细胞拆合与显微操作技术
?物理法结合显微操作技术(图1、图2)
?化学法结合离心技术
?制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。 ?其它技术
遗传分析（mutant, knock out, knock in） 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈
对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈
第四章 细胞质膜与细胞表面
?细胞质膜与细胞表面特化结构
?细胞连接
?细胞外被与细胞外基质 第一节 细胞质膜与细胞表面特化结构
细胞质膜(plasma membrane),又称细胞膜(cell membrane)。 细胞内膜(intracellular membrane); 生物膜(biomembrane) ? 细胞质膜的结构模型
? 膜脂——生物膜的基本组成成分 ? 膜蛋白
? 确定膜蛋白方向的实验程序 ? 光脱色恢复技术
? 分子生物学技术在膜蛋白研究上的应用 ?生物膜结构特征 ? 细胞质膜的功能
? 膜骨架与细胞表面的特化结构 第二节 细胞连接 ? 细胞连接的功能分类 ? 封闭连接 ? 锚定连接
?通讯连接
?细胞表面的粘连分子
一、胞质膜的结构模型 ?研究简史
?结构模型
?生物膜结构 结构模型
?E.Gorter和F．Grendel（1925）:
“蛋白质-脂类-蛋白质”三夹板质膜结构模型 ?J.D.Robertson（1959年）：
单位膜模型(unit membrane model)
?S.J.Singer和G.Nicolson（1972）：
生物膜的流动镶嵌模型(fluid mosaic model)
?K.Simons et al(1997): 脂筏模型（lipid rafts model） Functional rafts in Cell membranes. Nature 387:569-572
生物膜结构
?磷脂双分子层是组成生物膜的基本结构成分,
尚未发现膜结构中起组织作用的蛋白；
?蛋白分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面, 膜蛋白是赋予生物膜功能的主要决定者；
相关推荐：
loading