第二节 DNA片段的扩增——PCR技术
一、DNA在细胞内的复制
1．所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。 2．引物：一段RNA。 3．原料：四种脱氧核苷酸。 4．原则：碱基互补配对原则。 二、PCR技术的过程
1．把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg等成分加入到微量离心管中。
2．把离心管置于95℃的高温中，使DNA碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成为两条单链。
3．将离心管置于55℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。 4．再将离心管转置于72℃的环境中，在DNA聚合酶的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。
三、实验操作 1．准备
(1)为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为95℃、55℃和72℃，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。
2．扩增 3．检测
利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。即：DNA的浓度(μg/mL)A260nm
＝×稀释倍数。 0.02
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中
问题1 2＋
1
问题2 问题3 问题4
一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外)
不同点 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 边解旋边复制，半保留复制 不需要 受生物体自身控制 体内温和条件 ①需提供DNA复制的模板 ②四种脱氧核苷酸为原料 ③都需要一定的缓冲溶液 ④子链延伸的方向都是从5′端到3′端 解旋 引物 体内复制 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开 一小段RNA PCR反应 加热至95 ℃左右，双链全部解开，不需解旋酶 单链DNA分子片段 分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃ 体外迅速扩增 需要 30多次 高温(可变) 特点 TaqDNA聚合酶 循环次数 温度 相同点
①解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。
②DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
二、PCR技术的实验操作程序
2
1．PCR扩增前的准备
??高压灭菌移液?
??每次更换吸头
准备三个水浴锅 ↓
2．PCR扩增循环 预变性时间延长 最后一次延伸时间延长 ↓
3．检测PCR扩增效果 (1)稀释 ?2?测量光吸收值
?3?计算DNA含量↓
4．绘图(DNA的紫外线吸收曲线图)
PCR技术的原理及过程 如图为某一次循环的产物，请 据图回答问题。
(1)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为________、________、________三个步骤。
(2)PCR技术与细胞内DNA复制在解旋时原理不同：细胞内复制利用________使双链间氢键断裂，而PCR技术利用________原理，使双链氢键断裂。以引物为标识，可判断出此产物最早为第________次循环的产物。
(3)PCR反应中，如果以引物为标识，共有几种DNA分子产生？你能把它们画出来吗？ 【审题导析】
3
【精讲精析】 (1)PCR的每一轮循环包括高温变性、低温复性和中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。
(2)DNA分子在细胞内复制时。在解旋酶的作用下使氢键断裂，而在体外，DNA在95 ℃的高温中变性。即双螺旋解开，成为单链；当温度慢慢降低后，两条彼此分离的单链又会重新结合形成双链。在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会出现DNA分子两端均含引物的情况，如图所示：
因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。
(3)产生的DNA分子有3种：只含引物Ⅰ的，只含引物Ⅱ的和既含引物Ⅰ也含引物Ⅱ的。 【答案】 (1)高温变性 低温复性 中温延伸 (2)解旋酶 热变性 一 (3)共有3种，分别为：
当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到50 ℃左右时，引物与模板结合，一般不考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因：a.模板DNA比引物长得多而且复杂的多，不易重新结合；b.引物与模板间的碰撞机会远远多于模板互补链间的碰撞；c.加入的引物量足够大而模板链数量少。
PCR技术是把DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本过程如图所示：
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