凝胶层析法测定蛋白质分子质量

图4 洗脱体积Ve与蛋白质分子量的lgMw值线性拟合的标准曲线

线性拟合方程为Ve=-135.36lgMw+692.99，相关性系数的平方R2=0.9624，线性程度很好。根据这一标准曲线可以由未知蛋白的洗脱体积Ve计算未知蛋白的分子量。

2.未知蛋白分子质量的计算

未知蛋白质的有效分配系数为Kav=0.384012539, 根据标准曲线的线形拟合公式可以计算出未知蛋白的lgMr=4.680169699, 所以未知蛋白的分子量的值为Mr=47,882。

未知蛋白质的有效分配系数为Ve=59.7ml, 根据标准曲线的线形拟合公式可以计算出未知蛋白的lgMr=4.678560875, 所以未知蛋白的分子量的值为Mr=47,704。

以上结果汇总为下表6

蛋白质种类 分子量Mr 洗脱体积 有效分配系数 分子量对数 Ve（ml） 牛血清蛋白 鸡卵清蛋白 67,000 45,000 35.5 70.0 97.4 Kav 0.004746835 0.550632911 0.984177215 LgMr 4.826074803 4.653212514 4.380211242 胰凝乳糖蛋白24,000 酶原A 未知Kav 蛋 白 Ve 47,882 47,704 59.7 59.7 0.384012539 0.384012539 4.680169699 4.678560875 表6最终计算结果汇总表

3.实验结果的讨论

(1)对未知蛋白质分子量计算结果的讨论。

根据有效分配系数Kav计算得到的未知蛋白质分子量为Mr=47,882，根据洗脱体积Ve计算得Mr=47,704。二种方法所得到的数据基本一致，两者相差178，相对差值约为0.4%，在实验过程所允许的范围之内。

但是，理论上讲两种计算方法的结果应该是一致，造成误差的原因可能是第一次层析蓝色葡聚糖和未知蛋白之后，凝胶洗脱不充分，并且第二次层析标准蛋白这个过程中凝胶柱床Vt很可能发生变化。而且由于同样的原因，外水体积Vo也会发生变化。因此，两次层析实验过程中凝胶的物理性质即相关物理参数并不完全一致，导致由分配系数Kav和由洗脱体积Ve分别计算的Mr不一致。不过，由于总体上凝胶的各种性质并没发生明显的变化，所以最终所测得的未知蛋白分子质量相差很小。

（2）关于加样后加洗脱液引起的实验误差的分析

加样操作过程产生的方法误差：因为加入样品后即开始收集，而我们最后计算洗脱峰位置是根据收集的管数乘以每管计算得到的设定收液体积。所以在样品渗入胶床后停止收集液体再加入少许洗脱液润洗管壁的时间内我们没有收集液体，但自动收集器仍在记时，所以该管液体量应该少于设定的每管收液体积。在数据处理过程中，我们对该管仍按设定的每管3.2ml计算。所以该时间段直接

产生测量误差。其大小主要取决于操作者的熟练程度。所以我们在实验中应该尽量缩短该时间。

（3）实验中可能造成结果误差的原因分析。

第一，在实验相关参数测定中的系统误差和偶然误差。由于在测量柱床体积Vt，外水体积Vo，洗脱体积Ve时使用了量筒等测量工具，所以由于这些工具所带来的系统误差是很难完全避免的。同时，由于本次实验中每次层析实验只进行了一次，所以人为测量中的偶然误差也是很可能出现的。所以，如果能够多次重复实验，并将每次实验的结果取平均值，应该能够在一定程度上使得最终测定的未知蛋白质分子量更加准确。

第二，由于两次进行凝胶层析时所设定的恒流泵流速不同，因此可能导致在两次层析过程中分离效果不同，从而导致最终结果的误差。第一次层析过程中由于两个洗脱峰的间距较大，所以使用了2.75ml/5min/管的速度；而第二次前两个洗脱峰的间距很小，为使得两个洗脱峰能够充分分离，所以使用了1.6ml/3min/管的速度。因此，洗脱速度的不同可能导致两次实验的层析效果有一定的差别。由于这个差别，将用测定标准蛋白所得的标准曲线应用于未知蛋白时可能会产生误差。

第三，我们所测的洗脱体积和实际洗脱体积一般情况下是不一致。这是因为我们在用量筒测定体积时是把整管的收集液加入量筒中，所以所得体积一般不是洗脱峰峰值所对应的实际洗脱体积。不过由于两次层析时每管的体积只有2.75ml和1.6ml，所以最终体积的误差最多不会超过一个收集管的体积。因此在这个误差范围内，实验中用量筒测得的洗脱体积不会和实际体积有显著的差别。 （4）实验中注意事项

各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。

装柱要均匀，不过松也不过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不宜过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。

始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。

洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影响分离效果。

洗脱速度保持3-6ml/min，如果在洗脱速度太高，样品与凝胶将具有更少的时间来达到平衡，从而导致较差的分离。太低的洗脱速度，样品的扩散不能被忽略，并且将需要更多的时间。

操作压过大可使流速变慢，此外还可以导致凝胶胶面下降，柱床容积的改变，相应测出Vt，Vo，Ve等也改变，造成实验结果的误差。

使用部分收集器时，将其转盘调节到最外圈，从第一管开始，否则会造成转换臂的转动与转盘不同心，以致洗脱液流到管外。