实验二 热休克蛋白HSP90的PCR扩增技术
一、实验目的与原理简介
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程： 一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延伸。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：
1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.
2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
6）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 实验目的：学习PCR反应的基本原理和基本技术。 二 、材料和试剂
10Х扩增缓冲液
4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶
5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶
移液枪（0.5-10μL 5-50μL） 枪头 实验操作 1） 将各成分加到微量离子管内混合：
10Х扩增缓冲液 2.5μl 5端引物 1.5μl
3端引物 1.5μl DDW 15μl dNTP 2.5μl Taq酶 0.1μl
模板 1 μl 2） 按照以下方法进行PCR扩增： 预变性： 96oC 5min 30个循环： 95 oC 45min,60 oC 45min, 72 oC 150min； 延伸： 72 oC 10min
注：聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp的速率来计算出来的。 3） 抽取每种扩增样品5-10μl，用琼脂糖电泳来分析扩增结果， 用DNA marker 来判断扩增片段的大小 。凝胶一般用Goldview染色后观察扩增的量与片段大小。
从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR扩增的效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。 实验注意事项：对可能发生PCR过程中主要疑难问题的解析
PCR常见问题及解决方案 问题
可能原因
模板浓度偏低或偏高 模板降解
模板中含有抑制反应的杂质 引物浓度不足 引物存在二级结构 引物降解 Mg浓度偏低 无产物或产量低
dNTP降解
酶纯度低，扩增效率差 酶量不足 用酶不当 缓冲液失效 模板变性不充分 退火温度偏高 延伸时间不足 循环数目不够 PCR管污染 PCR仪故障 其他
2+
解决方法
电泳检测模板浓度，调整模板用量
重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存 纯化模板
调整引物浓度，特别是针对长片段PCR 重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度 引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融 适当提高Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度 -20℃保存，小量分装，避免反复冻融 选用高质量DNA聚合酶 适当增加酶量
针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)
更换缓冲液或使用预混PCR反应体系
适当延长变性时间；对高GC或复杂结构模板，提高起始变性温度至98℃
降低退火温度，应比引物Tm低至少5℃ 增加延伸时间，特别是针对长片段PCR 增加循环数
质量可靠的PCR管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭菌处理；用过的PCR管不可清洗后重复使用 检查程序和模块温度 使用PCR增强剂
体系污染 引物浓度过高 引物序列特异性差 Mg浓度过高 非特异产物过多
dNTP浓度过高 酶量过多 退火温度过低 延伸时间过短 循环次数过多
模板结构过于复杂或目标片段过长 其他
引物3’末端存在互补序列 引物二聚体
引物浓度过高 模板浓度过低 退火温度不合适 循环次数过多 其他 引物浓度过高
引物序列特异性差或模板上拖尾严重
存在同源序列 模板降解 模板浓度过高 dNTP浓度过高 Mg浓度过高
2+2+
设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染 适当减少引物浓度 重新设计引物
降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度 降低dNTP浓度
减少酶量，以0.5 U间隔递减 提高退火温度
增加延伸时间，以1 min间隔递增 减少循环次数
特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)；使用PCR增强剂 HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR 重新设计引物 降低引物浓度 提高模板浓度 优化退火温度 减少循环次数 HotStart PCR 调整引物浓度 重新设计引物 重新制备模板 降低模板浓度 减少dNTP用量
降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度
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