酶工程提纲

绪论

酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程。

酶活力的概念：是指酶催化一定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下酶所催化的反应初速度。（单位时间底物减少或产物增加）. 酶活力的单位：有两种酶活力的标准单位P17：

开特（kat）:是酶活力的国际单位（SI），它规定在特定的体系下，反应速度为每秒转化1mol 底物所需的酶量

在两种不同的酶活力单位之间换算：1Kat = 6X 107 U

酶的一个活力单位：在该酶的最适条件下，在250C，一分钟内催化1?mol(微摩尔）底物的酶量为一个国际单位，即IU

比活力的概念及计算：特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力

单位数。酶比活力=酶活力（单位）/mg(蛋白质或RNA)

纯化倍数等计算:

? 酶的转换数：酶的转换数(KP)，又称摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底

物转化的分子数。即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是酶催化效率的一个指标，单位为min-1

? KP=酶活力单位数（IU)/酶微摩尔数(μmol) ? 催化周期：转换数的倒数

固定化酶的概念：与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内起催化作用的酶 酶的生产方法：提取分离法 微生物细胞发酵产酶

生物合成法 植物细胞发酵产酶 化学合成法 动物细胞发酵产酶

第二章

? 酶的发酵生产方式：酶的发酵生产是当今大多数酶生产的主要方法 据微生物培养方式不同

固体培养发酵(如传统的酒曲、酱油曲 液体深层发酵（主要方式） 固定化微生物细胞发酵

固定化微生物原生质体发酵

产酶微生物的特点：酶产量高、产量稳定性好、易培养和管理、利于酶的分离纯化、

安全可靠无毒性

菌种培养方式：

酶生物合成的调节：定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节。

意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。

组成型酶：在细胞中比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大。 适应性酶：在细胞中含量很大，其合成速率明显受到环境的影响。 转录水平的调节：转录水平的调节是酶的生物合成中最重要的调节。

与酶生物合成有密切关系的基因：.调节基因：可产生一种阻遏蛋白 （一种变构蛋

白），通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 启动基因（启动子）有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。

CAP：分解代谢产物基因活化蛋白，又称环腺苷酸受体蛋白。

只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。

操纵基因:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。

结构基因:决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。

酶生物合成的模式4种：根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成

分为3种模式，即生长偶联型——同步合成型、中期合成型；部分生长偶联型——延续合成型；非生长偶联型 —— 滞后合成型。 （1）同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步。

特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。这类酶所对应的mRNA很不稳定。

（2）延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。

特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。 （3）中期合成型：该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。

特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。

（4）滞后合成型：此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。

特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。

各种模式的特点及最理想模式：延续合成型 发酵工艺条件的控制：①pH值的控制：

为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。

细菌与放线菌：pH7~7.5 酵母菌和霉菌：pH4.5~6范围内生长

调节pH值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；也可以使用缓冲液来稳定pH值；或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求。 ②温度的控制：

通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。

有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。 ③溶解氧的控制：

溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中溶解氧的量保持恒定。

溶氧速率是指单位体积的发酵液在单位时间内所溶解的氧的量。以Kd表示。其单位通常以[ mmol氧/h·L]表示。

控制溶解氧方法：调节通气量、调节氧的分压 、调节气液接触时间 、调节气液接触面积 、改变培养液的性质 。

提高酶产量的措施：首先，要选育或选择使用优良的产酶细胞，保证正常的发酵工艺条件并根据需要和变化的情况及时加以调节控制。

（1）添加诱导物：对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。

诱导物一般可以分为3类：酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物。

（2）控制阻遏物的浓度：阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。

产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。 分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。

为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。

对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。

（3）添加表面活性剂：表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。

将适量的非离子型表面活性剂添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶

的产量增加。

由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。

（4）添加产酶促进剂：产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清

产酶动力学概念（宏观、微观）：可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速

率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或非结构动力学。也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学或结构动力学。

4种产酶模式对应的方程：（同步合成型和中期合成型）生长偶联型： dE???X dt dE???X??X（延续合成型）部分生长偶联型 dt

dE（滞后合成型）非生长偶联型 ??Xdt

?m?SdX1?＝??莫诺德方程及莫诺德常数： dtXKs?S

S为限制性基质的浓度，um为最大比生长速率，是指限制性底物浓度过量时的比生长速率，即：当S》ks时，u=um,ks为莫诺德常数，是指生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性机制浓度，即，当u=0.5um时，s=ks.ks单位：g/L,mol/L.

稀释率:是指单位时间内，流加的培养液与发酵容器中发酵液体积之比，一般以/h为单位。 固定化细胞发酵产酶的特点：产酶率提高；可以反复使用或连续使用较长时间；基

因工程菌的质粒稳定，不易丢失；发酵稳定性好；缩短发酵周期，提高设备利用率；产品容易分离纯化；适用于胞外酶等胞外产物的生产。

第三章

植物细胞培养的工艺条件及其控制：

植物细胞培养的工艺流程：

外植体——细胞的获取——细胞培养——分离纯化——产物

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植物细胞获取的方法：从外植体获取植物细胞的方法主要有：

温度的控制（一般T为25℃）

pH值的控制（控制在微酸性范围， pH5.0—6.0) 溶解氧的调节控制(通过通风和搅拌来供给）

光照的控制（据植物细胞的特性以及目标次级代谢 前体的添加（添加目的代谢物的前体）

刺激剂的应用（如微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶）

（1）直接分离法