重复导致基因组DNA经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性(RFLP)。 9．计算下列三种酶各自在某染色体DNA序列上识别位点间的平均距离： Alu I：5’ AGCT 3， EcoR I: 5’GAATTC 3’ 3’TCGA 5， 3’CTTAGG 5’ Acy I：5’GPuCGPyC 3’ 3’CPyGCPuG 5’
(注：Py=任何一种嘧啶；Pu=任何一种嘌呤)
答：Alu I：(1／4)4=1／256 EcoR I：(1／4)6=1／4096
Acy I：(1／4)4(1／2)2=1／1024
10．何为回文序列？
答：回文序列（palindromic sequence）是一段自我互补的序列，即同其互补链一样的序列（两者的阅读方向都是从5’→3，)。
根据回文序列的结构可分为：完全的回文序列、不完全的回文序列和间断的回文序列。完全回文序列（如GAATTC），通常是限制性内切核酸酶的识别序列；不完全的回文序列（如TACCTCCAT, CGTGATA），常是其他蛋白质的结合位点(如阻抑蛋白)，在基因表达调控中有重要作用；间断的回文序列（如GGTTXXXAACC，有一段是颠倒的重复），它可使单链的核苷酸有可能在tRNA中所见到的一样，形成发夹环的结构。
聚合酶与修饰酶
一、填空题
1、连接酶（ligase）是一类用于核酸分子连接形成 磷酸二酯 键的核酸合成酶。
2．原核生物主要有两种类型的DNA连接酶：E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4 DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E．coli中分离的一种单链多肽酶，分子质量为 68 kDa，由T4噬菌体基因 30 编码。E．coli DNA连接酶是由大肠杆菌基因 51 编码，也是一条多肽链的单体，分子质量为 74 kDa。这两种DNA连接酶有两个重要的差异：①它们在催化反应中所用的能量来源不同，T4 DNA连接酶用 ATP ，而E．coli DNA连接酶则用 NAD+作为能源；②它们催化平末端连接的能力不同，在正常情况下只有T4 DNA连接酶能够连接平末端，E．coli DNA连接酶则不能。即使是调整反应条件，E．coli DNA连接酶催化平末端的连接效率也只有T4 DNA连接酶的 1/10 。
4． DNA聚合酶I的Klenow片段是用 枯草杆菌蛋白酶 切割DNA聚合酶I得到的分子质量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：① 5’→3’聚合酶活性 ；② 3’ →5’外切核酸酶 的活性。
5．反转录酶除具有以DNA和RNA为模板合成DNA的5’→3’合成酶的活性外，还具有四种酶的活性：① 5’→3’ 外切核酸酶活性；② 3’ →5’外切核酸酶活性 ；③ DNA内切酶的活性（Mn2+，切割SC DNA）； ④ 解旋酶的活性 。
6．为了防止DNA的自身环化，可用 碱性磷酸酶 脱去双链DNA 5’端得磷酸基团 。 7．切口移位(Nick Translation)法标记DNA的基本原理在于利用 DNA聚合酶I 的 5’→3’外切核酸酶 和 5’→3’聚合酶活性的作用。
8．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用 S1核酸酶切割 或 DNA聚合酶补平。
9．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有 核酸水解酶H 的作用，可以将DNA-RNA杂种双链中的 RNA 水解掉。
10．DNA连接酶 是基因克隆的分子黏合剂，而 限制性内切核酸酶 被誉为分子克隆的剪刀。
二、选项题（单选或多选）
1．T4 DNA连接酶是从T4噬菌体感染的E．coli中分离的，这种连接酶（ B ）。
A．催化连接反应时既能以ATP又能以NAD作为能量来源
B．既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接 C. 是一种单肽酶，分子质量为74kDa D．既能催化单链DNA连接又能催化双链DNA连接
2．DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，（ A ）。 A．将双链DNA分子中的5’磷酸基团同3'-OH末端重新形成磷酸二酯键
B．作用时不消耗能量 C．需要Mn2+等二价辅助离子 D．也可以连接RNA分子 3．在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA 互补链时应选用 （ D ）。
A. T4 DNA聚合酶 B．Klenow酶 C．大肠杆菌DNA聚合酶I D．T7 DNA聚合酶 4．末端转移酶是合成酶类，（ C ）。
A．作用时不需要模板 B．在Co2+的存在下，可以在突出的3’端延长DNA链 C．在Co2+的存在下，可以在隐蔽的3’端延长DNA链 D．上述说法有两种是正确的 5．在基因工程中，可用碱性磷酸酶 ( AB )。
A．防止DNA的自身环化 B．同多核苷酸激酶一起进行DNA的5’端标记 C．制备突出的3’ 端 D．上述说法都正确 6．从E．coli中分离的连接酶 ( B )。
A．需要ATP作辅助因子 B．需要NAD作辅助因子 C．可以进行平末端和黏性末端连接 D．作用时不需要模板 7．下列哪一种酶作用时需要引物? ( C )
A．限制酶 B．末端转移酶 C．反转录酶 D．DNA连接酶 8．S1核酸酶的功能是( BCD )。
A．切割双链的DNA B．切割单链的RNA C．切割发夹环 D．以上有两项是正确的 9．K1enow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了 ( C )的活性。
A．5’→3’ 合成酶 B．3’→5’ 外切酶 C．5’→3’ 外切酶 D．转移酶 10．只能从DNA分子的末端水解磷酸二酯键使核苷酸解离下来的酶是( A )。 A．核酸外切酶 B．核酸内切酶 C. DNA连接酶 D．末端转移酶
11．T4噬菌体DNA聚合酶具有两种活性：聚合酶活性和3’→5’外切酶活性（作用于3’突出端），因此可使黏末端变成平末端。如DNA片段用一定的限制性内切核酸酶处理后，再置于含T4聚合酶及四种三磷酸核苷酸的反应体系中，则下面哪种情况可能发生？( C )
A．在T4聚合酶的外切酶活性作用下，Bgl II (A↓GATCT)切出的末端被切平
B．在T4聚合酶的外切酶活性作用下，Bgl II及Pvu I(CGAT↓CG)切出的末端被切平 C．在T4聚合酶的外切酶活性作用下，Sac II (CCGC↓GG)及Pvu I切出的末端被切平 D．在聚合酶活性作用下，Bgl II及Pvu I切出的末端被补平
E．在聚合酶活性作用下，Sac II及Pvu I切出的末端被切平 12．逆转录酶也称反转录酶，是一种( B )。
A. 依赖于DNA的DNA聚合酶 B．依赖于RNA的DNA聚合酶 C. 依赖于DNA的RNA聚合酶 D．DNA聚合酶或RNA聚合酶 13．可以在切口部位起作用的酶是( A )。
A．S1核酸酶 B．外切酶III C．λ外切核酸酶 D．Bal 31核酸酶
三、判断题
1．T4 DNA连接酶和E．coli连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接。错误，平末端不能
2．T4 DNA连接酶和E．coli连接酶都能催化双链DNA和单链DNA的连接。错误，都不能催化单链连接
3．反转录酶能够以单链RNA或单链DNA为模板，在引物的引发下合成一条互补的DNA链。以RNA为模板合成的DNA是互补DNA (Complementary DNA，cDNA)。若是以DNA模板合成DNA，dNTP的掺入速度很低（每秒约5个核苷酸），是T7 DNA聚合酶合成速度的1％。正确
4．以RNA为模板，用反转录酶可同时产生单链和双链的cDNA，双链DNA是由自身引物引导合成。但这种自身引物引导的合成效率远低于外加寡核苷酸引物引导的合成。正确
5．Bal 31核酸酶是Ca2+依赖性的，在反应混合物中加入EDTA便可抑制它的活性。错误，EGTA抑制Ca2+
6．当一个DNA结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后，就保护了它们的磷酸二酯键免遭切割，其结果，电泳胶上就有明显可见的空缺带（与对照相比），这就是DNA足迹法。正确
7．T4 DNA连接酶和E．coli连接酶作用时都需要ATP和NAD+作为辅助因子。错误，T4连接酶需要ATP，E．coli需NAD+
8．多核苷酸激酶之所以能够用于DNA片段的标记，是因为它能够将单个的32P标记的单核苷酸加到每一DNA链的5’端。错误，将ATP上的3 2P加到
9．用同一种酶切割载体和外源DNA得到黏性末端后，为防止它们自身环化，要用CIP将它们脱磷酸。错误，不能同时脱磷酸，一般只将载体脱磷酸
10．Nick和Gap的含义是不同的，前者指DNA的单链中有较小的缺失，后者仅是断开了一个磷酸二酯键。错误，正相反
四、问答题
1．DNA连接酶的连接机理是什么？
答：DNA连接酶是利用ATP或NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]提供的能量催化DNA双链间的缺口形成磷酸二酯键。
在连接反应中，首先ATP (NAD+)与DNA连接酶反应，同连接酶生成一种共价结合的酶-AMP复合物。其中AMP(腺苷一磷酸)通过一种磷酸酰胺键同DNA连接酶的赖氨酸残基的ε-氨基相连。同时释放出焦磷酸或烟酰胺单核苷酸（NMN）。
AMP激活DNA一条链的5’-末端磷酸基团, 并转移到磷酸基团上，形成DNA-腺苷一磷酸复合物。最后，3’-OH对激活的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。
连接反应是由在形成酶-腺苷酸复合体时，焦磷酸水解和释放提供的能量驱动下进行的。在以ATP作为能源的连接酶中，一个磷酸二酯键的形成消耗掉两个高能磷酸键。 2．DNA连接酶的作用特点有哪些？
① 连接反应需要在一条DNA链的3’末端具有一个游离的-OH, 而另一条DNA链的5’ 末端具有一
个磷酸基团(-P)的情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用，而在末端带有5’-羟基和3’-羟基；5’-磷酸和3’-二脱氧核苷基团的两个DNA片段之间不起连接作用。 ② 连接反应中需要ATP或NAD+ 和Mg2+ 为辅助因子和激活因子； ③ DNA连接酶不能够连接两条单链的DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。 ④ DNA连接酶只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口 (Nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核
苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口（Gap）。
3．影响DNA连接酶连接反应的因素主要有哪些？
答：1) 反应温度：最佳反应温度37℃，但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定，连接黏性末端的最佳温度，一般认为4～20℃比较合适。
2) DNA片段末端：不仅要考虑反应体系中DNA末端的总浓度，还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个DNA分子的末端有较高的几率与另一 DNA分子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段 3：1 ~ 1：3。
3) 连接酶浓度：平末端DNA分子的连接反应，最适酶量大约是1～2单位；而黏末端DNA片段间的连接，在同样的条件下，仅为 0.1 单位时，便能得到最佳连接效率。 4．什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？
答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到的两个片段。其中大片段的分子质量为75kDa，它具有5’→3’聚合酶和3’ →5’外切核酸酶的活性，小片段具有5’→3’外切核
酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5’引物的5’→3’外切核酸酶活性，所以在基因工程中更有用。
Klenow酶主要有下列用途：
(1) 修复反应，制备平末端。可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5’或3’突出端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3’端标记的探针。用Klenow酶修复5’突出端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；而修复3’突出端则是用Klenow酶的3’ →5’外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3’突出端是不理想的，改用T4 DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。 (2) 标记DNA 3’突出端 (protruding end)。该反应分两步进行：先用3’ →5’的外切核酸酶活性除去3’突出端，产生3’隐含末端，然后在高浓度的标记底物 (32P-dNTP) 存在下，使降解3’ →5’) 作用与聚合 (5’→3’) 作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应 (exchange／replacement reaction)。不过这一反应用T4 DNA聚合酶的效果更好，因它的3’ →5’的外切核酸酶活性较强。
(3)其他的一些用途。包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法 (primer extension) 制备单链DNA探针等。 6．切口平移法制备DNA探针的原理是什么？
答：在Mg离子存在时，用低浓度的DNA酶I（DNase I）处理双链DNA，使之随机产生单链断裂。然后用DNA聚合酶I的 5'→ 3'外切酶活性可以从断裂处的 5' 端除去一个核苷酸，而其聚合酶活性则将一个单核苷酸添加到断裂处的 3' 端。随着反应的进行，即5' 端核苷酸不断去除，而 3' 端核苷酸同时掺入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象称为切口平移。如果在反应体系中加入放射性同位素标记的核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子，用作DNA分子杂交探针。
质粒及质粒载体
一、填空题
1、基因工程中有三种主要类型的载体： 质粒DNA 、 病毒DNA 、质粒和病毒DNA杂合体 。
2．由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同。SC DNA的泳动速度 最快 ，OC DNA泳动速度 最慢 ，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。
3．就克隆一个基因 (DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分： 复制子（含有复制起点）、选择标记（主要是抗性基因）、克隆位点（便于外源DNA插入）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。
4．如果两个质粒不能稳定地共存于一个寄主细胞中，则属于同一个不亲和群，这是因为它们的复制机制相同所致。
5．质粒拷贝数是指细胞中 质粒的份数同染色体的比值，即质粒／染色体 。
6．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫质粒消除（或治愈）。
7．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于 pMB1 ，它的四环素抗性基因来自于 pSC101 ，它的氨苄青霉素抗性基因来自于 pSE2124 (R质粒) 。
8．YAC的最大容载能力是 1000~2000kb ，BAC载体的最大容载能力是 300kb 。 9．把那些没有可检测表型的质粒称为隐蔽性质粒。
10．pUC18质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 pBR322 和 M13 两种质粒改造而来。它的复制子来自 pMB1 ，Amp抗性基因则是来自 转座子 。 11． Ti质粒 是自然界存在的植物基因工程的天然载体。
12．既能在E．coli又能在S．cerevisiae中自我复制的载体DNA称为 穿梭载体 。
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