[VIP专享]试验方案抗寒性

金光杏梅的抗寒性

一、电导率的测定

1.1．实验材料：金光杏梅的枝条

1.2．实验器材：10ml刻度试管，剪刀，电导仪，冰箱，天平，水浴锅，比色皿, 药匙，烧杯1.3．实验试剂：

　1.3.1．蒸馏水　　1.3.2.去离子水1.4．试验方法：

　　将供试1年生枝条用自来水和蒸馏水冲洗干净后放入冰箱中分别在，-10、-15、-20、-25、-30、-35的温度梯度下冷冻4小时后取出，放在4摄氏度冷藏冰箱中解冻，然后测其相关指标。每个指标测定重复3次,对照材料沙藏于4摄氏度的条件下。

　　取低温处理后的枝条，用去离子水冲洗干净，避开芽眼，剪成3-5毫米的薄片，混合均匀，称取一克放入刻度试管中，加10毫升去离子水，在室温下静止12小时后测定其初电导值（电导仪型号为DDS-11A）煮沸30分钟后，室温下静止5小时，再测其终电导值，得到相对电导率，logistic方程Y=K(1+ae-bx)(K=100%)计算各样品的半致死温度。

二、丙二醛含量的测定（ＭＤＡ）

２.1．实验材料：金光杏梅的枝条

２.2．实验器材：10ml试管，剪刀，721型分光光度仪，离心机，离心管３个，研钵研杵，水浴锅，移液枪，玻璃棒，５０ｍｌ烧杯３个，天平，比色皿, 药匙，２.3．实验试剂：1.3.1．蒸馏水　1.3.２.石英砂　　

1.3.３．ＮａｏＨ（氢氧化钠）

1.3.４．１０％ＴＣＡ溶液的配制：称取１０ｇTCA溶于90ml的蒸馏水中。

1.3.５． 0．6%硫代巴比妥酸(TBA)溶液的配制：0.6gTBA先用少量1mol/L NaoH溶解，再用10%ＴＣＡ定容至１００ｍｌ。２.4．试验方法：

２.4．１．枝条MDA含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法所用仪器为721型分光光度仪。称取剪碎的金光杏梅枝条1g,加入2ml质量分数为10%的TCA和少量石英砂，研磨。再加8mlTCA进一步研磨，在4000r﹒min-1离心10min，上清液样品提取液。２.4．２．显色反应和测定：吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml质量分数为0.6%的TBA溶液，混匀，将混合物于沸水浴上反映15min,迅速冷却后再离心。取上清液测定450、532和600mm波长下的消光度。２.4．３．MDA质量摩尔浓度的计算：

MDA质量摩尔浓度/（umol﹒g-1）=【6.45（A532-A600）-0.56A450】﹒N﹒W-1N---提取液体积（ml）；W---植物组织鲜重（g）.

三、斐林试剂比色法测定还原糖

3.1．实验材料：金光杏梅的枝条

3.2．实验器材：分光光度计，分析天平，离心机，水浴锅，具塞刻度试管，刻度吸管，４个100mL一个２５０ｍＬ容量瓶，研钵，恒温箱，移液管，试管，比色皿, 药匙，烧杯。3.3．实验试剂：

3.3．1．斐林试剂A液：4gCuSO4·5H2O溶解于蒸馏水定容至100mL 。3.3．2.斐林试剂B液：20g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·5H2O）与15gNaOH溶于蒸馏水中，并定容至100mL。A、B两液分别贮存，使用前等体积混合。

3.3．3. 0.1％葡萄糖标准液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸馏水溶解，定容至100mL 。3.3．4. 0.1mol/LNaOH。3.3．5.甲基红指示剂： 0.1g甲基红溶于250mL60％乙醇中。3.3．6. 10％Pb(Ac) 2 。3.3．7.饱和Na 2SO4。 3.4．试验方法： 3.4．１标准曲线的制作取7支试管，按表分别加入各溶液。还原性糖测定时绘制标准曲线的试剂量试剂管号00﹒1%葡萄糖标准液（ml）蒸馏水（ml）65432100112233445566每管含葡萄糖量（ml）斐林试剂(ml)01234564444444　　将以上各管混合后加塞，于沸水浴中加热15 min 。取出后自来水冷却， 590nm波长下比色，以蒸1500r/min离心15min。取上清液，用分光光度计在馏水作对照，读取吸光度。用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。3.4．２ 样品中还原糖的提取取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取3.00g，放入研钵中研磨至糊状，用水洗入大试管中。体积为加2～3滴甲基红指示剂，如呈红色，可用若用风干样品，可称取干粉

10～15mL时，

0.1mol/L的NaOH 中和至微黄色。

3.00g，先在烧杯中用少量水湿润，然后用水洗入

250mL容量瓶中，如显酸性，可用上法中和。

　将大试管置于80℃的恒温水浴中保温30min，其间摇动数次，以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品，此间可加白质至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和后取出冷却，将提取液全部转入测

　3.4．３样品测定吸取6mL待测液，加4mL斐林试剂，其他操作与标准曲线相同，在590nm波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量。 3.4．４结果计算

还原糖（%）=查的得糖毫克数×样品总体积×稀释倍数/（测定时取用体积*样品重×1000）×100

10％Pb(Ac) 2，除去蛋

Na 2SO4除去多余的铅离子。30min

100mL容量瓶中。定容至刻度，摇匀后过滤待

四、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量

４.1实验材料：金光杏梅的枝条

４.2实验器材：10ml具塞试管，离心管，研钵，研杵, 5ml移液管， 坐标纸，721分光光度计，比色皿，烧杯，天平，药匙４.3实验试剂:

４.3．１．双缩脲试剂：取CuSO 4·5H 20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。

４.3．2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）１０ｍｇ，再用0.9%NaCl溶解。并定容到１００ｍｌ即可。

４.3．3.KI(碘化钾) 酒石酸钾钠(c.P.) CuSO 4·5H 20（五水硫酸铜） NaOH（氢氧化钠）

4.4． 试验方法：[操作步骤]

取6支干燥洁净试管，编号，按下表加入试剂：

加入物（ml） 0 1 2 3 4 5标准蛋白液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

蛋白浓度（mg/ml） 0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0双缩脲试剂（ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0

混匀， 37℃水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。1～5为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度，在标准曲线上求得蛋白质浓度。 [注意事项]

1．双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠， Cu2+形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO

4·5H 20

不稳定形成Cu(OH) 2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO 4·5H 20之比不低于3∶1，

加入KI作为抗氧化试剂。

2．双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳

五、脯氨酸含量的测定

5.1实验材料：金光杏梅的枝条

5.2实验器材：具塞试管，剪刀，研钵，研杵，水浴锅，天平，玻璃棒，容量瓶(250ml,50ml)，721型分光光度计，比色皿, 药匙，真空干燥机，烧杯