TRIZOL Reagent
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Cat. No. 15596-026 Size: 100 ml Store at 2 to 8°C.
警告：在与皮肤接触及吞咽有毒。可导致烧伤。与皮肤接触后，应立即用洗涤剂和大量水冲洗。如感到身体不适，应就医（如需要，应出示本产品标签）。本产品含有苯酚（108-95-2）和其他成分（NJTSRN 80100437-5000P）。
已经证明TRIZOL 在室温下可稳定保存12个月。不过，我们建议在储存于2-8°C，以保证最佳性能。 描述：
TRIzol试剂（美国专利号，5346994）是即用型细胞和组织总RNA提取试剂。该试剂是一步法苯酚和异硫氰酸胍解决方案，是对Chomczynski和Sacchi开发的单步RNA提取法（1）的改善。在匀质化或溶解样品中，TRIzol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分离成水相和有机相。 RNA存在于水相。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，样品中DNA和蛋白质可通过相继沉淀
回收（2）。用乙醇沉淀可从中间相得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质（2）。 与DNA的共纯化可能对不同样品得到的RNA的归一化有用。
此技术可完美应用于少量人类、动物、植物或细菌来源的组织（50-100毫克）和细胞（5×106），以及大量的组织（≥1 g）和细胞（>107）。该TRIzol试剂方法简单，允许大量样本同时处理。整个过程可在一小时内完成。用TRIZOL提取总RNA可避免蛋白质和DNA污染。可用于Northern blot分析、斑点杂交、poly（A）+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。聚合酶链反应（PCR反应）中，当两条引物位于单个外显子时，推荐使用扩增级DNA酶I(Cat. No. 18068)处理分离出的RNA。
TRIzol试剂方便提取不同种类、不同分子大小的RNA。例如，从大鼠肝中提取RNA，
经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，高分子量RNA离散带其长度可高达7 kb和15 kb，(组成mRNA’s和hnRNA’s)，两个主要的核糖体RNA带在~5 kB（28 S）和~2 Kb（18 S）。低分子量RNA介于0.1和0.3 kB之间（tRNA，5S）。分离出的RNA用TE稀释，其A260/A280比值≥1.8。
防止RNA酶污染的注意事项
通过不当的技术操作，RNA酶可在任何提取程序中意外引入RNA的制备中。由于酶的活性难以抑制，所以必须防止其引入。进行RNA工作时，下列准则应予以遵守。
? 总是戴着手套。皮肤上通常包含的细菌和霉菌，可污染RNA的制备，同时也是RNA酶的一个来源。良好的微生物操作技术可防止微生物污染。
? 使用无菌制品，专为RNA工作准备的一次性塑料器皿和自动吸管可以避免与共用设备的RNA酶交叉污染。例如，一个实验室正在使用的RNA探针可能用得上RNA酶A或RNA酶T1以减少过滤背景，其中任何非一次性物品（如自动吸管）可能是大量RNA酶的来源。
? TRIzol试剂的存在，可保护RNA酶对RNA的污染。下游样品处理要求非一次性的玻璃器皿或塑料器皿无RNA酶。玻璃物品可以在150 °C烘烤4小时，塑料制品，可浸泡10分钟的0.5 M NaOH溶液，然后用清水彻底冲洗，并高压蒸汽灭菌。
其他需要注意的事项：
? 用小于2毫升体积的TRIZOL试剂工作时，建议使用一次性透明聚丙烯管。
? 对于较大的体积，用玻璃（Corex）或聚丙烯管，并测试以确保该管装满TRIzol试剂和氯仿时可承受12,000×g的离心力，不要使用泄漏或有裂纹的管子。 ? 离心前小心平衡管子的重量
? 玻璃管必须用封口膜密封，密封时封口膜要覆盖有螺丝处，聚丙烯管离心前必须盖好。
RNA提取的指导：
警告：当使用TRIzol试剂工作时，应使用手套，并保护眼睛（屏蔽、安全护目镜）。避免与皮肤或衣服接触。使用化学通风橱。避免吸入蒸气。
除非特别注明，所有程序均在15 -30°C下进行，试剂也放置于15 -30°C。
需要的试剂为： ? 氯仿 ? 异丙醇
? 75% 酒精(溶于DEPC处理的水中)
? 无RNase 的水或0.5% SDS溶液 [RNase-free水的准备：把水加入到RNase-free的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC)至0.01% (v/v). 静置过夜，高压蒸汽灭菌。SDS溶液必须使用DEPC处理的水，并高压灭菌。]
1. 均质化 (see notes 1-3) a. 组织
均质50-100毫克组织样本需要1毫升的TRIzol试剂，使用特富龙玻璃?或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER? TISSUMIZER ?或相当的仪器）。均质时样本体积不应超过TRIzol试剂体积的10％。 b. 单层细胞
直接在培养皿中裂解细胞，3.5厘米直径的皿中加入TRIzol试剂1毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。TRIzol试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10平方厘米加入1毫升）。TRIzol试剂量不足可能会导致分离出的RNA有DNA的污染。 c. 悬浮细胞
离心沉淀细胞。在TRIzol试剂中重复吹打以裂解细胞。1毫升试剂用于5-10×106的动物、植物或酵母细胞，或1×107细菌细胞。使用TRIzol试剂前应避免洗涤细胞，因为这增加了mRNA降解的可能性。一些酵母和细菌细胞的裂解可能需要使用均质器。
可选: 一些样品可能需要额外的分离步骤，这些样品蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高，如肌肉、脂肪组织、以及部分植物块茎。同质化之后，2-8°C、12000 × g离心10分钟，移除不溶物。由此产生的沉淀含有细胞外膜结构、多糖、分子量高的DNA，而上清含有RNA。从脂肪组织等脂肪过多的样本收集的上层脂肪应弃去。在每种情况下，均应转移净化后的均质溶液到新管，加入氯仿进行下述相分离。 2. 相分离
15-30 °C孵育5分钟，以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。每1毫升的TRIzol试剂添加0.2毫升氯仿。小心盖好样品管。用手大力摇管15秒，15-30°C孵育2-3分钟。2-8°C，不超过12,000 ×g离心15分钟。离心后，混合物分离为红色下层（酚-氯仿相）、中间相以及上层的无色水相。 RNA存在于水相。水相体积约为60％均质时使用的TRIzol试剂量。 3. RNA沉淀
水相转移到一个新管，并保存有机相（如希望分离DNA或蛋白质）。混合异丙醇以从水相中沉淀RNA。每1毫升用于初始的同质化的TRIzol试剂使用0.5毫升异丙醇。15到30℃孵育样品10分钟，2-8°C，不超过12,000 ×g离心10分钟。往往离心前RNA沉淀不可见，离心后在管侧面和底部形成一个凝胶样沉淀。 4. RNA洗涤
弃上清。用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂使用至少1毫升75％的乙醇。涡旋混合。2-8°C，不超过7,500×g离心5分钟。 5. 重新溶解RNA
在该过程结束时，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟）。不要真空离心干燥RNA。重要的是不要让RNA沉淀完全干燥，因为这将大大降低其溶解度。部分溶解RNA样品，其A260/280比值<1.6。在无RNA酶的水中或0.5％ SDS溶液中吹打几次溶解RNA， 并在55-60°C孵育10分钟。（如RNA将用于之后的酶反应，应避免使用SDS。）RNA也可以用100％甲酰胺（去离子）再溶解并保存于-70℃（5）。
RNA Isolation Notes:
1. 从少量组织（1-10毫克）或细胞（102-104）分离RNA：加入800μl TRIZOL 到the tissue or cells.样品裂解后，加入氯仿，遵循上述步骤2进行相分离。在异丙醇沉淀的RNA之前，加入5-10微克无RNA酶的糖原（Cat. No 10814），以承载水相。为了降低粘度，加入氯仿前以2-26号针头剪切基因组DNA。糖原保留在水相，与RNA一起沉淀下来。浓度高达4 mg/mL的糖原既不抑制第一条链的合成，也不抑制PCR。
2. 同质化后，加入氯仿前，样品也可以存放在-60至-70℃至少一个月。 RNA沉淀（步骤4，RNA洗涤）可以存储在75％乙醇中2-8℃至少一周，或在-5至-20 ° C至少一年。 3. 最大离心力只有2,600 × g的桌面型离心机也适合用于这些程序，只是在步骤2和3中，其离心时间应提高到30-60分钟。
DNA提取的指导:
如RNA分离方法所描述，完全除去水相后，位于中间相和苯酚相的DNA可被能分离。经沉淀和系列洗涤，DNA可溶解于8 mM氢氧化钠。使用TRIzol试剂可从组织和培养细胞完全回收DNA，可用于分析样品DNA含量（2）。同时提取的基因组DNA可用于每个基因组northern结果的归一化分析，而不是使用变动更大的总RNA或组织的重量。 （根据来源，在进行其他程序之前，获得的DNA沉淀可能需要额外纯化（如酚提取））。
需要的试剂： ? 100%乙醇
? 0.1 M 柠檬酸钠 in 10% 乙醇 ? 75% 乙醇 ? 8 mM NaOH
除非特别注明，所有程序均在15 -30°C下进行。
1. 沉淀DNA
移去水相后，用乙醇沉淀中间相和有机相中的DNA。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加0.3 毫升100%乙醇，颠倒混合。然后，15-30℃静置2-3分钟，2-8°C，不超过2,000×g离心5分钟以沉淀DNA。
仔细移去水相，对于分离DNA的质量很重要。
2. DNA洗涤
移去苯酚-乙醇上清液（如需要，保存上清用于蛋白质分离）。用0.1M的柠檬酸钠溶液（溶于10%乙醇）洗两次沉淀的DNA。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加1 毫升溶液。每次清洗时，15-30℃静置30分钟DNA沉淀（间歇混匀），2-8°C，2, 000×g离心5分钟。洗涤2此后，用75％乙醇悬浮沉淀的DNA（每毫升TRIzol试剂加入75％乙醇1.5-2毫升），在15-30 °C静置10-20分钟（间歇混匀），然后2-8°C，2, 000×g离心5分钟。
对于包含> 200 μg DNA或大量非DNA物质的大沉淀，需要0.1M柠檬酸钠-10％乙醇溶液额外的洗涤。
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