项目名称：凋亡蛋白酶在登革病毒性肝损害发生中作用的研究
－１－ 登 革 出 血 热 / 休 克 综 合 症 的 发 生 机 理 尚 不 明 了 ， 新 近 研 究 表 明 ： 登 革 病 毒 NS1 研究内容和意见 摘 要 蛋 白 可 能 参 与 登 革 休 克 的 发 生 。 本 研 究 运 用 分 子 生 物 学 技 术 ， 制 备 NS1 蛋 白 及 其 抗 体 ， 用 流 式 活 性 细 胞 分 蛋 白 与 血 管 内 皮 细 胞 的 结 合 率 及 抗 类 法 分 析 NS1 其 对 内 皮 细 胞 骨 架 蛋 白 的 影 响 ； 整 合 素 α2 体 有 否 阻 段 效 应 ； 实 施 动 物 实 验 ， 分 析 感 染 后 血 清 NS1 主题词 中文 英文 蛋 白 浓 度 与 疾 病 进 展 的 相 关 性 。 1.主题词数量不多于三个; 2.主题词之间空一格(英文用/分隔) 登 革 病 毒 N S 1 蛋 白 内 皮 细 胞 Dengue virus/ NS1 protein/ Endothelium 简表填写要求
一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最 新发布的《国家自然科学基金项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术 新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写。申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请 书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。
二、凡选择栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。 三、部分栏目填写要求：
项目名称－应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。 基础研究－指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。 应用基础研究－指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。 申报学科－申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。 申请金额－以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。
起止年月－起始时间从申请的次年1月算起，终止时间为完成年度的12月。
所用实验室－系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的 开放实验室。
所在单位名称及代码－按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填 “中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如： 中国航天工业总公司第七O一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未 编入单位代码，其代码暂不填写。
参加单位数－指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位），
以阿拉伯数字表示。
项目组主要成员－指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作 用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。 研究内容和意义－摘要与主题词均录入软盘。
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二、立论依据
（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义： 对应用基础研究，着重结合学科前沿，围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。 登革热病毒（Dengue Virus）是属于黄病毒属的正股单链RNA病毒，它以蚊虫为媒介，主要引起登革热和登革出血热/休克综合症(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS)。后者为危及患者生命的急症，死亡率极高，主要死因为出血,休克和肝损害。在我国南方及东南亚，西太平洋，中南美洲均有流行。据报告，每年世界上热带和亚热带地区约有 1亿人的健康受到该病毒的威胁。登革感染已成为上述地区严重的公共卫生问题。 肝损害是登革出血热的三大死亡原因之一，但其发生机理尚不明了,缺乏合适的动物模型是肝损害发生机理不能深入研究的重要原因。在日留学期间，申请者将对登革敏感的人类肝癌细胞株（HepG2）移入严重免疫功能不全(SCID)小鼠体内，再用登革病毒感染HepG2移植SCID小鼠，从而建立了该病毒感染的小鼠模型，首次在动物身上成功地再现了某些DHF/DSS的症状，为该病发生机制的研究奠定了良好的基础(Virology,1999)。利用该模型，我们对感染后肝脏损害情况做了初步观察，发现感染后早期（3 -5天），64%小鼠肝脏的主要病理变化为肝细胞出现凋亡小体,并伴有不同程度的血清转氨酶升高和病毒血症. 以往的临床观察也发现：登革病毒感染后常有肝脏受累的表现，如黄疸，肝肿大，血清转氨酶水平升高。尸检可见肝组织内出现凋亡小体，脂肪变性，枯否氏细胞肥大等。我们的结果和临床的研究报道是一致的。这提示肝细胞凋亡可能是登革病毒感染早期肝脏损害的重要病理基础。因而，弄清登革病毒感染后细胞凋亡发生的机制，对于阐明肝脏损害的致病机理十分重要，而且，对其早期治疗途径的探索也具有特殊意义。 目前，在复杂的细胞凋亡信号调控系统中，凋亡蛋白酶家族和核因子NF-kB的作用颇引人注目。细胞凋亡蛋白酶是1994年发现的哺乳动物蛋白酶，家族成员有10个以上，其中，凋亡蛋白酶3，8，9与细胞凋亡的关系尤为密切，而凋亡蛋白酶8和9位于3的上游，通过激活3引起该系统的级联反应，是引发细胞凋亡的一条重要途经。 NF-kB是一种具有多向调节作用的核内蛋白质，正常情况下，以无活性形式存在于细胞浆内，当某种因素（炎症，应激，感染等）使之激活后，NF-kB的二聚体从抑制亚单位中释放出来转移至核内，与DNA的特定部位结合，启动基因转录，从而参与细胞凋亡的调控，是细胞应激反应的重要调控分子。研究证明：多种病毒如艾滋病毒，流感病毒，巨细胞病毒和辛得比斯 (Sindbis) 病毒均能激活NF-kB；此外也有报道认为NF-kB参与调节应激状态肝损害后肝细胞基因的表达。提示NF-kB的活化与肝损害发生和转归关系密切。但NF-kB在登革病毒性肝损害发生中的作用尚不清楚。由于NF-kB和凋亡蛋白酶共同参与某些炎症和非炎症性疾病的发生，我们推测：登革病毒的增殖及其蛋白产物在细胞内的堆积可能激活NF-kB和凋亡蛋白酶，二者协调作用的失衡可能是感染后肝细胞凋亡发生的重要调节因子。因而，本项目拟利用体外培养体系和活体动物实验，研究感染后NF-kB和凋亡蛋白酶3，9 活性的变化及其在肝细胞凋亡发生中的作用。旨在阐明登革热病毒感染后肝损害的发生机理，并寻找有效的拮抗剂，在基因转录启动或信号系统激活的早期，阻断细胞凋亡的发生，探索登革热病毒性肝损害的治疗方法。本研究一旦有所发现，对于其它病毒性肝炎发生机理的阐明和治疗必将具有普遍意义。 主要参考文献： 1. An,J., Kimura-kuroda,J., Hi.rabayashi,Y. K.Yasui.(1999).Development of a novel mouse model for dengue virus infection. Virology 263,70-77. 2.Yamazaki,Y. et al (2000): Cytoskeletal disruption accelerates caspase-3 activation in DNA damage-induced apoptosis. Ex. Cell Res.259:64-78. 3.Nakajima K. et al(2000), Structure,expression and function of the Xenopus laevis caspase family. J.B.C, 275:10484-10491. 4. Bitzer M et al(1999): Sendai virus infection induces apoptosis through activation of caspase-8(FLICE) and caspase-3(CPP32). J.virol.73;702-708 5.Geisbert,TW et al (2000):Apoptosis induced in vitro and in vivo during infection by ebola and marburg viruses.Lab.Invest.80:171-185 6.Takizawa T et al (1999): Recruitment of apoptotic cysteine proteases(caspases) in influenza virus-induced cell death. Microbiol.Immunol,43,245-252,1999. 7. Clem RJ et al(1998): Modulation of cell death by Bcl-XL through caspase interaction. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 95;554-559 8. Hida A et al(2000), Nuclear factor kappa B and caspases co-oeratively regulate the activation and apoptosis of human macrophages, Immunol.99:553-560. 9.安静，等： dengue viru感染 マウスモデルを用いた T cell の病 に与える作用。日本第48届病毒学会。2000。三重 10.Havert,MB et al (2000):Activation of divergent neuronal cell death pathways in different target cell populations during neuroadapted sindbis virus infection of mice. J.Viorl.,74:5352-6. －3－ 三、研究方案
１．研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 研究内容： (1) HepG2 细胞的培养 ：DMEM 含10?S，常规培养， 小鼠肝细胞的培养：首先用灌流方法分离肝细胞，然后常规培养。 胎儿肝细胞长期培养方法的建立。 (2) 感染实验：用登革热病毒分别感染HepG2 细胞、小鼠肝细胞和胎肝细胞，做下列分析。 (3) 观察指标； ① 细胞的形态学变化，特别是嗜酸小体的出现； ② 病毒的增殖滴度的检测和病毒蛋白在细胞内分布情况的观察。 ③ 从感染细胞中抽出核酸产物，分析DNA的降解。 ④ 检测感染细胞之细胞凋亡的发生率及与病毒增殖的关系。 ⑤ 检测感染细胞NF-kB因子的活性变化和和凋亡蛋白酶3 .8活性的变化并 分析二者与病毒增殖和细胞凋亡发生的相关性。 ⑥ 抑制NF-kB与DNA的结合或四肽化合物DEVD-CHO抑制凋亡蛋白酶，观察其对细胞凋亡发生的影响。 （4）动物实验的实施：利用已建立的登革感染小鼠模型，从整体水平经时观察感染后肝功能的变化，肝脏组织形态学变化特别是细胞凋亡的发生率及整体条件下寡核苷酸和四肽化合物对细胞凋亡发生的抑制作用。 预测目标： （1） 阐明NF-kB和凋亡蛋白酶在登革热病毒引发的肝细胞凋亡中的作用。 （2） 初步解明PDTC (Prrylidine dithiocarbamate)或四肽化合物（DEVD-CHO）对肝细胞凋亡的抑制作用。 拟解决的关键问题： 阐明NF-kB和凋亡蛋白酶在登革出血热之肝脏损害中的作用及其机理。寻找拮抗剂，为病毒性肝损害的早期治疗开辟新途径。 －４－
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