分子生物学实验论文
——抗氨苄青霉素基因重组子的构建
学生姓名 所在专业 学 号 所在班级 指导教师 完成时间
刘菲菲 植物病理学 200950023412 09级研究生四班 刘铀 老师 2010/6 /10
抗氨苄青霉素基因重组子的构建
摘要：转基因通常是指利用一定的载体和导入方法将目的基因导入细胞，使其在靶细胞内表达。质粒是最常用的载体，与植物线性DNA 相比， 稳定性好，保存期长。而且质粒上总是有1个或多个可赋予宿主细胞以某些有用特性的基因，如质粒上的抗生素基因。这些抗生素基因在克隆技术中常被用作选择标记，以选择和鉴定重组子。在基因克隆中使用最广泛而且结构最简单的载体一般都来源于较小的细菌质粒，如大肠杆菌中所存在的这种质粒载体，不仅易于纯化，转化效率高。在这次实验中首先通过PCR 技术获得目的基因，目的基因与质粒经过双酶切后进行体外连接，再用化学转入法转入感受态细胞进行扩增，通过PCR鉴定结果可知，该实验成功的获得了目的抗氨苄青霉素基因。 关键词：转基因；质粒；转化；抗氨苄青霉素；PCR
1 前言
转基因通常是指利用一定的载体和导入方法将目的基因导入细胞，使其在靶细胞内表达。然而目的基因片段很难直接转入感受态细胞，而且由于它自身常无DNA复制所需信息，在细胞分裂时不能复制给子细胞，从而丢失。所以人们要把它连在一些能独立于细胞染色体之外复制的DNA片段上，这些DNA片段就叫载体。
常用的载体有质粒和病毒。其中质粒是最常用的载体，与植物线性DNA 相比， 稳定性好，保存期长。它通常是DNA环状分子，可以独立地存在于细菌细胞中，而且质粒上总是有1个或多个可赋予宿主细胞以某些有用特性的基因，如质粒上的抗生素基因可以使宿主细胞在一定浓度的氯霉素或是氨苄青霉素等抗生素存在的培养基中存活。这些抗生素基因在克隆技术中常被用作选择标记，以选择和鉴定重组子。在基因克隆中使用最广泛而且结构最简单的载体一般都来源于较小的细菌质粒，如大肠杆菌中所存在的这种质粒载体，不仅易于纯化，转化效率高。选择重组子方便，而且可携带的外源目的基因的容量也较大(大约5kb)。因此，一些常规克隆实验都用质粒载体。质粒除了在细菌细胞中广泛存在外，其他细胞中并不普遍存在，如在真核细胞中仅发现极少的几种质粒．其中研究最深的是酵母中的2urn环(2um circle)，人们已经将其构建成了能在酵母中表达的载体，使基因工程的应用范围得以扩大。
质粒作为基因工程载体必须具备以下条件，①复制子：一段具有特殊结构的DNA序列；②有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；③有一个或几个限制性内切酶位点。便于外源基因片段的插入；④适当的拷贝数。制备质粒载体是分子生物学的常规技术。重组质粒存在于极易人工培养的大肠杆菌中， 可以源源不断地获得。因此，本实验首先通过PCR 技术获得目的基因，然后与质粒载体连接，再用化学转入法转入感受态细胞进行扩增，最后获得目的抗氨苄青霉素基因。
2 材料与方法
2.1 材料 2.1.1 实验材料
质粒：本实验室保存；大肠杆菌DH5α：本试验室保存；目的基因：本试验室保存。 2.1.2 主要试剂
Trypton，Yeast Extract，NaCl，琼脂粉，双蒸水，三蒸水，Amp，1%琼脂糖凝胶，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液，DNA marker，dNTPs：100bp ，普通Taq聚合酶，BamHI，HindIII，T4连接酶，质粒抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒。其它主要试剂均使用进口或国产分析纯。
2.1.3 主要仪器和设备
PCR仪，台式高速离心机，电泳仪，电泳槽，紫外检测仪，凝胶成像分析系统，培养箱，制冰机，超净工作台，-80℃冰箱。 2.2 实验方法
本实验首先通过PCR 技术获得目的基因，然后与质粒载体连接，再用化学转入法转入感受态细胞进行扩增，最后获得目的抗氨苄青霉素基因。主要实验步骤包括：感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、碱裂解法抽提质粒DNA、PCR反应扩增目的基因、目的基因与载体的酶切与回收、目的基因与载体的连接、重组DNA的转化和重组DNA的酶切鉴定。
2.2.1 感受态细胞的制备
挑取大肠杆菌单菌落接种于3mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；取1mL培养好的菌液接种于含有100mL LB液体培养基500mL 三角瓶中，37℃激烈振摇（200r/min）培养2-2.5h，待OD600值达到0.5-0.6时，立即将三角瓶取出置于冰浴中15min，4℃ 3500r/min离心10min，彻底弃去上清液，菌体用5mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，冰浴10min，再于4℃ 3500r/min离心10min，倾去上清液，用0.5用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌液，然后加灭菌甘油轻轻混匀，分装至小管，每管50uL，80℃冻存过夜，即可用于转化。 2.2.2 质粒DNA的转化
取上述制备的感受态细胞50uL，加入空质粒1uL，混匀后冰浴15min，42℃热休克90S，迅速转移到冰浴中冷却2min，加入200uL不含抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床中以150r/min振荡培养45min，取100uL菌液涂布于LA平板中，37℃培养过夜。 2.2.3 碱裂解法抽提质粒DNA
使用质粒抽提试剂盒，具体步骤如下：
1.大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至1~4mL的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。
2.取1~4mL的过夜培养菌液，12000rpm离心2分钟，弃上清。 3.用250uL的Solution I（含RNase AI）充分悬浮细菌沉淀。
4.加入250uL的Solution II轻轻的上下翻转混合5~6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。
5.加入400uL的4℃预冷的Solution III，轻轻地上下翻转混合5~6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置4min。
6.室温12000rpm离心10min，取上清。
7.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
8.将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。 9.将500uL的Rinse A加入Spin Column中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。 10.将700uL的Rinse B加入Spin Column中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。 11.重复操作步骤10。
12.将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50uL的60℃的灭菌蒸馏水，室温静置1分钟。 2.2.4 PCR反应扩增目的基因
2.2.4.1 反应混合液的配制：在一个0.5mL PCR管中加入下列成分：
模板 2uL 引物1 2uL 引物2 2uL 10×Buffer 10uL dNTP 5uL Taq酶 1uL ddH2O 78uL
充分混匀，离心片刻，使液体沉至管底。 2.2.4.2 PCR反应条件
循环1：94℃，3分钟。循环2-31：94℃变性45s、52℃退火45s、72℃延伸1min。共30个循环。最后72℃延伸10分钟。反应结束后，取5uL反应物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，其余置于4℃保存备用。 2.2.4.3 PCR产物的纯化
①向PCR产物加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，充分混匀；
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