SDS-PAGE电泳标准操作规程
(SOP)
一.仪器装置
1.电泳仪
2.夹心式垂直电泳槽
3.玻璃板:长1
4.5×11.5×2mm、短14.0×11.5×2mm
4.可调微量移液器
5.微量进样器
6.转移脱色摇床
二.试剂配制
1.丙烯酰胺液(30%T/
2.7%C)
用天平分别称取58.4g丙烯酰胺(Acr)和1.6g N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis),溶于120ml温热(37℃左右,以利于溶解Bis)的去离子水中,然后转移至200ml容量瓶中,补加去离子水至刻度,摇匀,用滤纸过滤后,检查其pH值应不大于7.0,贮存在棕色瓶中,4℃保存。每隔2个月重新配制。
小心:丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应戴手套。如不慎接触皮肤,应立即用水和肥皂清洗。
2.分离胶缓冲液(1.5M Tris-HCl,pH8.8)
用天平称取36.3g三羟甲基氨基甲烷(Tris),溶于160ml去离子水中,用HCl调pH 值至8.8~8.9(先加5ml浓HCl,再逐滴加1M HCl调节),用去离子水定容至200ml,置棕色瓶中4℃保存。
3.浓缩胶缓冲液(0.5M Tris-HCl,pH6.8)
用天平称取12.1g Tris,溶于160ml去离子水中,用HCl调pH值至
6.7~6.8(先加8ml浓HCl,再逐滴加1M HCl调节),用去离子水定容至200ml,置棕色瓶中4℃保存。
4.10% 十二烷基硫酸钠溶液
用天平称取20.0g 电泳级十二烷基硫酸钠(SDS),加180ml去离子水,68℃水浴使溶解后,用去离子水定容至200ml,室温保存。
5.10% 过硫酸铵溶液
用天平称取0.50g过硫酸铵(APS),溶于5ml去离子水中,分装Eppendof管冰冻保存。
6.四甲基乙二胺(TEMED)液
7.分离胶覆盖液((0.375M Tris-HCl,pH8.8,0.1% SDS)
取分离胶缓冲液25ml、10% SDS溶液1.0ml,混匀,加去离子水定容至100ml,室温保存。
8.1% 溴酚兰指示液
用天平称取1.0g溴酚兰(BPB),加0.05M NaOH溶液3ml使溶解,用去离子水定容至100ml。
9.2X样品缓冲液(0.125M Tris-HCl,pH6.8,4% SDS,20% 甘油,10% 巯基乙醇)
取浓缩胶缓冲液2.5ml、10% SDS溶液4.0ml、甘油2.0ml、巯基乙醇1.0ml、溴酚兰指示液0.5ml,混匀,分装Eppendof管冰冻保存。(生物秀实验频道www.bbioo.com)
注:非还原型电泳中样品缓冲液不加巯基乙醇,其它均相同。
10.电泳缓冲液(0.05M Tris,pH8.3,0.384M甘氨酸,0.1% SDS)
用天平称取12.1g Tris,57.6g甘氨酸,加10% SDS溶液20ml,再加去离子水定容至2L。(此溶液一般可使用4~5次,当电泳胶染色后出现较多杂带和本底时,应重新配制。)
11.染色液储存液(1% 考马斯亮兰R-250)
称取2.0g考马斯亮兰R-250,加去离子水溶解并定容至200ml,滤纸过滤(以除去颗粒状物质)。
12.染色液(0.125% 考马斯亮兰,50% 乙醇,10% 乙酸)
取染色液储存液62.5ml、乙醇250ml、乙酸50ml,加去离子水至500ml。
注:50% 乙醇也可用45% 甲醇代替,但甲醇毒性比乙醇大,不建议使用。
13.脱色液I(50% 乙醇,10% 乙酸)
取乙醇500ml、乙酸100ml,加去离子水至1L。
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