液相色谱-核磁共振联用技术在药物分析及体内药物分析中的应用

液相色谱－核磁共振联用技术在药物分析

及体内药物分析中的应用

摘要：本文详细的介绍了液相色谱——核磁共振联用的原理和操作技术，列举了该技术在药物分析及体内药物分析之中的应用；讨论了目前液相色谱——核磁共振在实际工作中存在的主要问题及其适用条件。

关键词：高效液相色谱，核磁共振，药物分析，体内药物分析 前言

液相色谱- 核磁共振(LC- NMR)联用技术并不是一个新概念。早在 70 年代末就有LC- NMR 联用技术的报道。将高分离能力的高效液相色谱(HPLC)与提供最丰富结构信息的NMR 结合似乎是很自然的事, 实际上由于这两种技术存在着固有的矛盾:NMR 的检测灵敏度明显比HPLC 低, 且作为HPLC 流动相的混合溶剂往往产生多重强溶剂峰而影响溶质峰的正确检测, 因此HPLC 和NMR 的联用并不是两种技术的简单组合。 长期以来人们一般先用HPLC 对混合物进行分离, 然后将分离好的组分移至NMR 试管中，再进行NMR 检测, 最后确定混合物中该组分的结构, 整个过程要耗费很多时间。近年来随着NMR理论和技术的发展, 出现了许多新技术新方法。 高性能脉冲梯度场技术和选择激发技术的出现, 使得多重溶剂峰的有效抑制成为可能。高场探头性能的不断改进, 大大提高了NMR 的检测灵敏度。NMR 谱仪的模块化设计和硬件的快速控制, 使得接口设计更为灵活。这些技术解决了HPLC 和NMR 的匹配问题。 由于HPLC- NMR 一体化联用技术能一次性完成从样品的分离纯化到峰的检测、 结构测定和定量分析, 提供大量分子结构和混合物组成的信息, 提高了研究效率和灵活性, 因此引起人们的广泛关注, 并获得快速发展。本文主要阐述液相色谱- 核磁共振的原理、操作技术,讨论液相色谱- 核磁共振在实际工作中存在的主要问题及其适用条件。并列举了该技术的药物分析及体内药物分析之中的应用。

1.液相色谱- 核磁共振的原理

样品注入高效液相色谱系统内，在高压泵的推动下，各组分得以分离，并依次经

过常规的紫外(UV 或 DAD)检测器，此后柱流出液可通过聚四氟乙烯导管直接或间接流入超导核磁共振仪内部，就实现了 LC - NMR 的联用。LC -NMR联用技术需要解决LC和NMR的接口、流体匣(flowcell)的设计、溶剂峰压制、液相和核磁溶剂的选择和 NMR灵敏度等问题[2 ] 1.1 LC - NMR的流体匣和探头

LC - NMR内部的核心探测系统是一个 U 形的流体匣，这是专门为 LC - NMR 设计的探头(probe)装置[2 ]。流出紫外检测器的组分通过聚四氟乙烯的毛细导管直接流入流体匣内 ,流体匣中有一鼓起的部分，为流体匣的测量部位，其直径为 2～4mm，体积为 60～250μL。检测线圈(detection coil)则直接围绕在该测量部位的外围，这样可以得到最佳的填充系数 (filing factor ,Φ =Vs / Vc ,Vs 和 Vc 分别代表样品和 NMR 线圈的体积)，使样品与线圈之间作用最紧密，大大提高了灵敏度。流体匣出口通常接入废液瓶或者样品收集器。 1.2NMR的灵敏度

众所周知，NMR的灵敏度是比较低的，这也是制约HPLC—NMR发展的问题。NMR的信噪比与样品浓度、磁场强度、检测线圈的填充因子、弛豫时间、扫描次数等有关。高场强（700M、800M甚至900M）NMR的运用，以及软件滤波、消噪技术的发展，都极大地提高了NMR的灵敏度。此外还可采用超低温的探头和前置放大器，由于低温冷却电子元件可减少电子元件的噪音，因此可使NMR的灵敏度提高三至四倍[3、4]。随着技术的进步，利用HPLC—NMR进行复杂微量天然产物的研究将变得更加容易。

1.3 溶剂的选择和溶剂峰压制

由于 HPLC 的流动相中含有大量的H，它将产生比被分离的化合物强的多的NMR信号。因此要从中检测到微量的样品信号，必须采用适当的脉冲序列来抑制溶剂的信号。目前最常采用的抑制溶剂峰的脉冲序列是在混和时间和弛豫延迟期内对溶剂的共振信号进行选择性照射的常规一维 NOESY序列，用于一维谱测试；此外还有基于脉冲场梯度的 WET (water suppression enhanced through T1 effect s)序列，可用于一维和二维谱测试。此外，使用氘代溶剂作为 HPLC 的洗脱液，可以很好的抑制洗脱液信号，从而降低对 NMR动态范围的要求。 1.4 HPLC分离条件的优化

由于 NMR 的信噪比(S/ N)与样品的浓度和测定时间的平方根成正比，因此使尽量多的样品进入流体匣的有效区域是非常重要的。直接 LC - NMR的灵敏度还取决于流体匣的有效体积(active volume)与色谱峰的洗脱体积(流速 ×峰宽)之间的比例。在大部分应用常规色谱柱进行的直接 LC - NMR 分析中，仅有 25 %～ 60 %的样品可在探头中被测量。因此，优化 HPLC 的操作条件 ,如待测样品的溶解度、洗脱溶剂及洗脱条件的选择等[5 ]，争取达到尽量大的载样量和尽量尖锐的色谱峰是非常必要的。开发新型 HPLC分析条件有助于充分发挥 HPLC- NMR的作用，如以 C30固定相代替常规的 C8 或 C18固定相，允许更大的进样量、改善峰形并更好地分离各组分，保证对较复杂混合物中微量组分的结构鉴定。 2.HPLC- NM R 联用装置和特点

在HPLC- NMR 联用系统中，HPLC 可以看作是NMR 的一种进样装置，试样经HPLC分离后，通过一个适当的中间连接装置注入到NMR 探头。由于HPLC 分离和NMR 分析的样品都处于液体状态，使用温度范围也相近, 因此这两种谱仪联用时不必作太多的改动。图1给出了一种典型的HPLC- NMR 联用装置。它是由泵、紫外检测器、色谱柱和注入阀组成LC 系统，通过一条2~2.5m长的特制毛细管连接到NMR 液相探头上。位于NMR 探头底部的阀用来控制NMR 测试是在停流状态下还是在连续流动状态下进行。在图1 所示的系统中，可以将NMR 视为HPLC 的特殊检测器。我们知道，HPLC 所用的检测器F I D、TCD、ECD 和R I等都有局限性，而NMR 信号的化学位移、积分强度和谱线分裂情况能提供丰富的定量定性信息。

3.高效液相色谱—核磁共振联用技术在药物分析中的应用

LC—NMR联用技术能使微量天然混合物中主要组分的化学结构及立体结构得到证实，充分体现了其微量、快速的特点。王映红等[6]建立了检测微量级蛇葡萄Ampelopsis sinica根提取物中混合组分结构的HPLC—NMR法,采用停止流动的方法对混合物的各个组分进行分离并获得1H NMR及COPY谱,结果鉴定出其中主要成分的结构为白藜芦醇四聚体。次年他们[7]又联合微量探头技术对蛇葡萄根提取物、买麻藤属植物提取混合物垂子买麻藤(Gnetum endulum C．Y．Cheng)、景洪哥纳香(Gronithalamus Cheliensis)提取混合物进行了分离鉴定[8]。 3.1实验方法[6] 3.1.1仪器及实验条件

蛇葡萄根（8kg）用95%的酒精提取三次，所得浸膏（430g）在沙氏提取器中提取，以氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇分别提取。乙酸乙酯部分（66g）用硅胶柱分为七份（A-G) 第五份（E）通过硅胶柱又分为六份（E1-E6），E1通过MPLC得到一份混合物（2mg)。采用Varian公司的LC-NMR联用仪，其中高效液相色谱仪为Prostar-230，分析柱为Inertsil ODS-3 柱（250*4.6nm）。 流动相为D2O，CH3CN，采用梯度洗脱，其洗脱比例为D2O:CH3CN=57:43（0-10min），以后逐渐增加乙腈的比例至40分钟时达到D2O:CH3CN=40：60，流速为1ml/min，检测器为Varian Prostar-330二极管振列检测器，紫外检测波长为280nm。将2mg混