浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)
1材料与仪器
1.1实验材料
从市场上随机选择3种配制酒. 1.2实验仪器
Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪配二极管阵列检测器（Agilent公司）； 固相萃取柱：Oasis HLB cartridge (3 cc，60 mg Waters公司 )。
液相色谱柱：Agilent SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent 公司)； 氮吹仪:HGC-36A，(天津市恒奥科技发展有限公司） 分析天平：AL204-IC。(Mettler Toledo公司) 1.3实验试剂
标准物质：β-苯乙醇(≥99%)、苯乙酮(≥99%)、丁香醛(≥99%)、肉桂醛(≥99%)（Sigma-Aldrich公司），甲醇为色谱纯（Merck公司）；实验用水为Milli-Q超纯水；
标准溶液的配制：分别准确称取β-苯乙醇、苯乙酮、丁香醛、肉桂醛100 mg于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1.0 mg/mL的储备液，密封储存于4 ℃冰箱中；再准确吸取1.0 mg/mL 的标准储备液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容得100 μg/mL的中间标准溶液。用流动相将中间标准溶液稀释成一系列浓度的标准溶液，待测。
2.实验方法
2.1色谱条件
液相色谱柱：Agilent SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent 公司)；柱温:40 ℃；进样量20 μL；流动相：甲醇水梯度洗脱，流动相如表2.1所示，流速1.0 mL/min。检测波长：β-苯乙醇：210 nm、苯乙酮：245 nm、丁香醛、肉桂醛：298 nm。
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表2.1 流动相梯度
时间 （min） 0.0 4.0 17.0 21.0 21.2
2.2样品前处理
水 （%） 80.0 80.0 40.0 20.0 80.0
甲醇, （%） 20.0 20.0 60.0 80.0 20.0
准确移取10 mL配制酒样品加纯水稀释，使其酒精度小于12 %vol。HLB固相萃取柱用3 mL甲醇，3 mL水活化，完全转移稀释后的样品过固相萃取柱，保持1滴/秒的流速。样品通过固相萃取柱净化后，用5 mL水清洗后慢慢排干水分，5 mL甲醇洗脱，40 ℃氮气吹至近1mL，用水定容至2 mL，0.22 μm滤膜过滤，待测。
3结果与分析
3.1色谱条件的优化
流动相梯度选择：在不影响分离效果的前提下, 为提高分离效率, 采用梯度洗脱。考察了甲醇比例在20%～80%时的洗脱状况, 确定了洗脱梯度(见表2.1)。
检测波长：将4种芳香物质在190 nm～350 nm作紫外光谱扫描， 得到各物质的最大吸收波长：β-苯乙醇为210 nm、苯乙酮244 nm、丁香醛310 nm、肉桂醛291 nm。试验检测波长为210 nm、245 nm和298 nm时各物质的响应情况，各物质的响应均很高，故将检测波长定为210 nm、245 nm和298 nm。4种物质的光谱图如图3.1所示。
不同色谱柱分离效果的比较：本实验选择了3 根C18 色谱柱，在不同的色谱分离条件下对相同的样品进行分析，比较分析结果，最终发现用Agilent SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)的分离效果最好。
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图3.1 四种芳香物质的光谱图: 1.β-苯乙醇 2.苯乙酮 3.丁香醛 4.肉桂醛
3.2固相萃取条件的优化
配制酒的酒精度通常为12% vol～52% vol，由于酒精度可能会影响目标物在柱子上的萃取效率，因此实验首先考察不同的酒精度对固相萃取效率的影响。实验采用Oasis HLB cartridge (3mL，60 mg )柱，对不同酒精度（12% vol, 15% vol, 22% vol, 28% vol, 32% vol, 38% vol, 42% vol, 48% vol, 52% vol）10 mL的溶液(加标浓度2 mg/L)进行固相萃取实验，对流出液进行分段收集，检测最后1mL流出液是否含有目标物。结果表明，酒精度小于等于15 %vol的测试液，流出液未检出目标物，说明此时目标物在固相萃取柱上的保留为100 %。
选择12% vol和15% vol，两种不同酒精度标准液模拟测试各目标物在HLB萃取柱上的最大保留体积。用加标溶液(2mg/L)进行测试，接取分段流出液上机检测。12% vol和15% vol的标准液过柱后检测到目标物时的体积分别为80 mL和70 mL。结果表明，随着酒精度的增加，检测目标物越早，说明酒精度越高对目标物的洗脱作用越强，综合考虑采用12%的乙醇溶液进行后续实验，对实际样品中酒精度大于12 %的样品采用加入一定比例的纯水稀释的方法达到12 %。 3.2.1 不同固相萃取柱效果的比较
本实验考查了五款固相萃取柱：Waters Oasis HLB cartridge (3mL/60 mg )、Waters Oasis MCX cartridge (3mL/60 mg )、Waters C18(3mL/60 mg )、Agela Cleanert PWAX (3mL/60 mg )、
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Agela Cleanert PCX (3mL/60 mg )对各目标物的保留情况。
将10 mL溶液加标2 mg/L 的12 %乙醇水过柱，5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近1mL，用水定容至2mL，上机测得回收率如表3.1。
表3.1不同固相萃取柱回收率
固相萃取柱 Waters Oasis HLB Waters Oasis MCX
Waters C18 Agela Cleanert PWAX Agela Cleanert PCX
β-苯乙醇, %
93.1 60.3 11.3 31.3 52.6
苯乙酮,% 98.8 73.6 19.4 72.9 72.3
丁香醛,% 99.2 78.8 13.0 69.7 74.5
肉桂醛,% 101.4 92.8 33.8 68.5 90.9
通过上表的数据可以看出，Waters Oasis HLB柱的回收率最高，故本实验选择该柱对样品进行净化浓缩。 3.2.2洗脱液的选择
将10 mL溶液加标2 mg/L的12 %乙醇水，过Oasis HLB cartridge (3mL/60 mg )柱，分别用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近干，用水定容至2 mL，上机。结果表明，5 mL甲醇能完全洗脱吸附在HLB柱上的目标物，故选其作为洗脱剂。 3.3线性范围及检出限
对四种物质的标准液进行检测，以仪器响应的峰面积Y对应浓度X进行线性回归，得到各物质的标准曲线方程、线性范围和相关系数。各物质在相应浓度范围内的线性良好，结果列于表3.2。采用空白样品处理液加标，以S/N=3计算方法的检出限，以S/N=10计算方法的定量限，再折算样品的检测限和定量限。
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