0.25 μ是光学显微镜的极限分辨率 数值孔径越大，波长越短，分辨率
数值越小，而显微镜分辨能力越高。 ?I＝26.4％ d=0.61 ? / NA
光学极限分辨率是由光的衍射特性决定的
3．放大率（magnification M）
放大率（M）=物镜放大率(M1) × 目镜放大率(M2 )
物镜放大率：M1= ? / F1
有限远光路：?：镜筒长度，物镜后焦面至目镜前焦面的 F1：物镜焦距。 无限远光路： ?： 镜筒透镜的焦距
目镜放大率： M2 = 250 / F2
250mm：眼到物的明视距离 F2：目镜焦距。 M2的放大率不超过16倍。
4．景深－焦点深度（focal depth）DF 景深表示清晰的像平面所能对应物平面前后空间的深度；或指焦点与样品上某点相一致时，能看清这一点及其上下两侧的结构，那麽，清晰部分的厚度即景深，也称之为焦点深度。
DF＝1/7NA*M +λ/2NA2
式中：
DF ：景深 NA : 数值孔径NA M ：总放大率
距离(160mm）。
λ:光波波长, 单位:mm
注：放大倍数越大，数值孔径越大，显微镜景深越小。
5.镜像亮度（light of image, L） 镜像亮度与数值孔径的平方呈正比，与总放大率的 平方呈反比。 L = NA2/ M2, M2 = ( M1 × M2) 2
注意： 在同一放大率下选用不同数值孔径的物镜，其镜像亮度不同。数值孔径越高，镜像亮度越高。数值孔径相同或相差不大的情况下，物镜倍率越高，镜像亮度越暗。这一点在观察荧光样品时尤其要注意，应权衡选用适当的物镜。 NA对荧光图像的亮度尤其重要。 6. 物镜工作距离 物镜工作距离越长，NA越小。
Confocal中要观察厚的样品时，在相同倍率下，数值孔径接近的情况下，应选择工作距离长的物镜来观察。 63x/1.32 oil L: 0.07mm
63x/1. 2 w L: 0.22mm
聚光镜
组成和作用： 由前端透镜、可变孔径光阑组成。作用是改变入射光的强度，调节光束大小，使光源发出的光线形成一束与物镜数值孔径相适应的光束，达到均匀照明标本的目的。
可变孔径光阑 可变孔径光阑是聚光镜中非常重要的装置，由于各个物镜的数值孔径不同,要求照明光束的孔径角也相应的变化,因此,聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑，此光阑即为可变孔径光阑。
聚光镜分为干、湿两种。
所谓“ 湿”即使用时需滴上浸液.这类聚光镜NA为1.2～1.4。“干”使用时不需滴浸
液,NA常为0.9。徕卡还备有干、湿两用的聚光镜，NA 0.9/NA 1.25。
数值孔径为0.9的聚光镜与孔径为1.25的100倍油镜配合使用,其分辨率不会降低。因为可变孔径光阑的大小可以为物镜数值孔径的2/3?3/4,即1.25*3/4=0.94,NA0.9干聚光镜正好与之相适应,也免去操作者滴油及清洁的麻烦。 对于特别追求鉴别率的场合,则应采用湿聚光镜,使用时,应在载玻片与聚光镜上表面滴上相应的浸液。
柯勒照明：是一种较为完善的照明方式，目的是得到最好的 像。严格的柯勒照明必须符合 下面三个条件：
反差和最清晰的图
－照明均匀，灯丝像位于聚光镜的前焦面上，通过聚光镜以平行光束照明标本。 －孔径光阑大小可任意改变，以适应不同倍率物镜的需要。
－具有可变的视场光阑，以适应不同倍率物镜的不同照明范围需要。 第二节 物镜的分类和标识 一、物镜的分类
（一）按像差校正程度分类：
1．消色差物镜
它校正了球差,彗差和二种色光的位置色差。此类物镜存在严重的轴外像差,特别是场曲。对￠18mm中间像而言(以下同),成像的清晰范围约50%,即视场中心调节清晰后,边缘像模糊不清,反之,边缘像调节清晰后,视场中心像模糊不清。物镜外壳无特殊标记。徕卡的BME及DME显微镜的物镜就属此种类型。此类物镜为最低档物镜，适于普通明场观察。 2．平场消色差物镜 它在消色差物镜基础上,还校正了像散和场曲,像面平坦。清晰范围不低于90%。物镜外壳刻有PL或 N PLAN字样。徕卡的产品目录中,N PLAN物镜就属于此类物镜。 3．半平场消色差物镜
这类物镜的清晰范围介于消色差物镜与平场消色差物镜之间,但明显优于消色差物镜。接近平场消色差物镜。其外壳常刻有C PLAN字样。 4.平场半复消色差物镜
色差的校正程度介于平场消色差物镜与平场复消色差物镜之间。但较近于平场复消色差物镜。物镜外壳刻有PL FLUOTAR，此类物镜通常作为观察荧光的物镜来使用。 5．平场复消色差物镜 它在平视场消色差物镜的基础上,还对第三种色光校正了位置色差,这种物镜成像质量最佳,其数值孔径也较同倍率物镜大。因此,鉴别率也最高，也更适于用来观察荧光。物镜外壳刻有PL APO字样（此类物镜为最高档物镜）。 （二）、按筒长分类
1．筒长有限远
物镜的共轭距离(物到像的距离)为195mm,物镜的机械筒长(物镜 螺纹端面（物镜后焦平面）到目镜支承面（目镜前焦平面）)为160mm。徕卡产品中BME,CME采用此类物镜。
2．筒长无限远
物镜把物体成像于无限远, 因此, 必须要有镜筒透镜将无限远的光线聚焦到目镜焦面上才能观察。徕卡产品中DME,DMLS,DMLB… 等均采用此类物镜。
此类物镜的突出优点是,在物镜与镜筒透镜之间可方便地插入各种附件,而不会引起成像位置的变化，镜筒上有∞ 标识。
（三）、按功能分类 1.相差物镜：徕卡产品中此类物镜上刻有PH1（2或3）， 差环使用。
2.偏振光物镜：徕卡产品中此类物镜上刻有POL。
3.微分干涉差物镜：徕卡产品中此类物镜上刻有D（E或 是代表此类物 拉斯顿棱镜使用。
C、A、B），该字母一
合相应的屋
数字表明应配合相应的相
镜为微分干涉差物镜，二是表明应配
（四）、按工作距离分类：
1.长工作距离镜头：徕卡产品中此类物镜上刻有 L，通常用 于倒置显微镜，用来观察培养
皿的细胞。此类物镜的特点数值孔径低，非常不适于观察荧光。低倍物镜（≦ ×10) 通 `常为长工作距离物镜,不需要标称L 。
2.可变工作距离镜头：徕卡产品中此类物镜上刻有CORR， 适用于不同厚度的盖薄片。
二、物镜外壳的标识
40x/0.65 40x： 有限远物镜,放大率为40倍 160/0.17 0.65：数值孔径NA 160：机械筒长160mm
0.17：盖玻璃厚度(消色差物镜) N PLAN 40x/0.65 N PLAN：平场消色差
∞/0.17 40x：无限远物镜,放大率为40倍 0.65: 数值孔径NA ∞: 筒长无限远 0.17: 竖玻璃厚度 第二节 物镜的分类和标识 第三节 相差显微镜 二、光学原理
相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，使相位差变成振幅差，表现出明暗对比，
使人眼能辨认无色透明物体的细节（如培养的活细胞）。 在相差显微镜中，为了实现相位变化向振幅变化的转变，在光路中必须满足下列两个条件： 1)要能够区分通过物体的直射光和在物体中被衍射的光。
2)应改变非衍射光即直射光的相位和振幅，以产生进行相干干涉的最佳条件。 因此，相差显微镜中利用环状光阑（相差环）和相位板来减少直射光的强度（振幅），并推迟直射光或衍射光的相位，从而创建产生相干光和干涉的条件。
三、装置
1.环状光阑：大小不同的环状孔做成光阑，透明部 分透光，位于多功能聚光镜支架处， 与相应相差物镜配合使用，此类物镜由“Ph”表示。 作用：把直射光与衍射光所成的像分开。
2.相位板：为一种玻璃板，其上装有两种膜，即： 相位膜与吸收膜；两种膜重叠在一个区
域范围。
位置：安装在相差物镜内，位于物镜的后焦平面 处。
1）相位膜：喷镀氟化镁。
作用：推迟直射光或衍射光的相位 相位板的符号：
A相位板：推迟直射光1/4波长使直射光和衍射光处在同一相位上，两种光干涉合成光为二者振幅之和 结果：物体亮，背景暗，明反差。
A－相位板：推迟衍射光1/4波长，使直射光和衍射光差1/2波 光振幅为二者振幅之差 结果：物体暗，背景亮，暗反差。 2）吸收膜：喷镀铬、银
作用：使直射光能量衰减75％
第四节 微分干涉相位差显微镜（DIC）
微分干涉差显微镜也是用来观察未染色的活体细胞，它是利用偏振方向不同的偏振光产生光的干涉，使物体边缘的高度差，成为光的振幅差，而形成反差来观察透明物体。 一、偏振元件 1.偏振片 自然光（全方位振动的光）通过某个光学元件后转换成只在某个方向振动的偏振光，这种元件称为偏振元件。更确切的说，应称为起偏振器。常用的起偏振器可用来使自然光转换成直线偏振光。它们是利用反射与折射，双折射和二向色性（或称选择吸收）的原理制成的。
第四节 微分干涉相位差显微镜 二、光学原理 微分干涉差显微镜和相差显微镜一样也是用来观察透明的位相物体。相差显微镜是利用透过标本细节的衍射光和周围介质的直射光，对直射光或衍射光加以干扰，使两光束满足相干条件，而达到相位差变振幅差的目的。微分干涉差显微镜是使两束偏振光中一束通过标本细节，另一束通过周围介质，进而使两束偏振光满足相干条件，以其光程差的变化转变成振幅差来观察未染色的物体。 第四节 微分干涉相位差显微镜
第四节 微分干涉相位差显微镜
自然光经过振动方向为45°起偏振器后成为线偏振光射向屋拉斯顿棱镜。此棱镜由二个光轴正交且平行于入射面和出射面的双折射晶体胶合而成。通常由石英晶体或方解石晶体制成。一束线偏振光在棱镜的胶合斜面上分离成二束振动方向互相垂直的寻常光(O)和非寻常光(e),由于棱镜位于聚光镜的焦面上,经聚光镜后O光和e光平行地剪切位相物体。然后经物镜后聚焦在物镜的后焦面上。所谓屋拉斯顿棱镜2与屋拉斯顿棱镜1相仿,其差别仅仅其中一个棱镜的光轴与出射面成一定的角度.目的使O,e光的汇合在一起,棱镜胶合面使汇合点与物镜后焦面重合.这样,O,e光经此棱镜后,O光变e光,e光变O光,但又合二为一.但振
长，两种光干涉，合成
＋
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