___________急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶及抗氧化酶活性的影响<p><br/></p>

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2018，49（10）：2087-209510期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·2087·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.10.27急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶及

抗氧化酶活性的影响

刘亚娟1,2,3，胡

重点实验室，广州

静1,2，周胜杰1,2，彭晓瑜4，马振华1,2,4*

572018；2农业农村部南海渔业资源开发利用

BT2728）

300384；4海世通（文莱）渔业有限公司，斯里巴加湾市

（1中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心，海南三亚

510300；3天津农学院，天津

摘要：【目的】明确氨氮对尖吻鲈（Latescalcarifer）稚鱼消化酶及抗氧化酶活性的影响，为提高尖吻鲈仔、稚鱼养殖存活率及丰富尖吻鲈养殖生态学理论提供依据。【方法】对15日龄的尖吻鲈稚鱼进行急性氨氮胁迫试验，分别于氨氮胁迫0、6、12、24、36、48、72和96h时测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶及脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）、胰蛋白酶（TRYP）等消化酶活性，揭示急性氨氮胁迫下尖吻鲈稚鱼抗氧化酶及消化酶的变化规律。【结果】氨氮胁迫下，5mg/L处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性在胁迫36h后显著高于对照组（P<0.05，下同），10mg/L处理组除胁迫72h外，其他时间点均低于对照组；5mg/L处理组尖吻鲈稚鱼POD活性随胁迫时间的延长始终高于对照组，10mg/L处理组在胁迫6~36h时远高于对照组，但低于5mg/L处理组；5mg/L处理组尖吻鲈稚鱼CAT活性在整个试验过程中均显著高于对照组，10mg/L处理组的CAT活性变化波动明显，整体上呈上升—下降的交替式变化趋势；5mg/L处理组尖吻鲈稚鱼ACP活性呈先下降后上升的变化趋势，且从试验开始后各时间点均显著低于对照组，10mg/L处理组整体上呈上升—下降—上升—下降的变化趋势；5和10mg/L处理组的尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性变化趋势基本一致，先保持相对稳定，后随胁迫时间延长呈上升—下降—上升的变化趋势。在消化酶方面，5mg/L处理组尖吻鲈稚鱼LPS活性从氨氮胁迫36h起显著低于对照组，10mg/L处理组从胁迫12h起呈上升—下降—上升—下降的变化趋势；5和10mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性整体上呈先下降后上升的变化趋势，而TRYP活性均呈阶段性的上升—下降交替变化趋势。【结论】氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶及抗氧化酶具有明显影响，在短时间（<6h）内尖吻鲈稚鱼对氨氮有一定耐受性，SOD、CAT等部分抗氧化酶在氨氮浓度的剧烈变化下其活性诱导增强以消除体内过多的自由基，消化酶活性呈不同程度的升高则是为了补充机体能量消耗。

关键词：尖吻鲈；稚鱼；氨氮胁迫；抗氧化酶；消化酶中图分类号：S965.211

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2018）10-2087-09

Effectsofacuteammonianitrogenstressonantioxidantenzymes

activityanddigestiveenzymesactivityinlarvalLatescalcarifer

2，3222，4*

LIUYa-juan1，，HUJing1，，ZHOUSheng-jie1，，PENGXiao-yu4，MAZhen-hua1，

（1TropicalAquacultureResearchandDevelopmentCenter，SouthChinaSeaFisheriesResearchInstitute，Chinese

2

AcademyofFisherySciences，Sanya，Hainan572018，China；KeyLaboratoryofSouthChinaSeaFisheryResources

3

ExploitationandUtilization，MinistryofAgricultureandRuralAffairs，Guangzhou510300，China；TianjinAgriculture

4

University，Tianjin300384，China；Hiseaton（Brunei）FisheriesLtd.，BandarSeriBegawanBT2728，Brunei）Abstract：【Objective】Theeffectofammonianitrogenonthedigestiveenzymeactivitiesandantioxidantenzymeac-tivitiesoflarvalLatescalcariferwasclarified，providingbasisforimprovingthesurvivalrateoflarvalL.calcariferandenrichingtheecologicaltheoryofbreeding.【Method】TheacutestressofammonianitrogenonlarvalL.calcarifer（15daysposthatching）wasconducted.Antioxidantenzymeactivitiessuchassuperoxidedismutase（SOD），peroxidase（POD），catalase（CAT），acidphosphatase（ACP），glutathioneperoxidase（GSH-Px）anddigestiveenzymeactivitiessuchaslipase（LPS），amylase（AMS），trypsin（TRYP）weremeasuredinthestresstimeof0，6，12，24，36，48，72and96htore-vealthechangeregulationoftheactivitiesofantioxidantenzymesanddigestiveenzymesinlarvalL.calcariferunderacuteammoniastress.【Result】Understressofammonianitrogen，SODactivityoflarvalL.calcariferfromthe5mg/L收稿日期：2018-05-12基金项目：海南省重点研发计划项目（ZDYF2017036）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项项目（2017ZD01，2018ZD01）；

海世通（文莱）渔业有限公司科技攻关项目（海世通科攻2017001）

作者简介：*为通讯作者，马振华（1981-），博士，副研究员，主要从事鱼类繁殖与发育研究工作，E-mail：zhenhua.ma@hotmail.com。

刘亚娟（1993-），主要从事鱼类繁殖与发育研究工作，E-mail：1137921867@qq.com

·2088·南方农业学报49卷experimentalgroupafter36hwassignificantlyhigherthanthecontrolgroup（P<0.05，thesameasbelow）.SODactivity

oftheindividualsin10mg/Lexperimentalgroupwassignificantlylowerthanthatinthecontrolgroupatallothertimepointsexceptfor72h.PODactivityoflarvalL.calcariferfrom5mg/Lexperimentalgroupwasalwayshigherthanthecontrolgroupwiththeextensionofstresstime，andPODactivityof10mg/Lgroupweregreatlyhigherthanthecontrolgroupbutlowerthan5mg/Lgroupfrom6hto36hofstress.CATactivityofthefishfromexperimentalgroupwassignifi-cantlyhigherthanthecontrolgroupinthewholeprocess.CATactivityof10mg/Ltreatmentgroupfluctuatedgreatly，showinganalternatingtrendofup-down.Inthe5mg/Ltreatmentgroup，ACPactivityoflarvalL.calcariferdecreasedfirstlyandthenincreased，andwassignificantlylowerthanthecontrolgroupafterthestartofexperimentatalltimepoints，butinthetreatmentgroupof10mg/L，theoveralltrendofincrease-decrease-increase-decreasewaspresented.GSH-Pxactivityofthefishintheexperimentalgroupsof5and10mg/Lwerebasicallyconsistent，whichremainedstablefirstly，andthenexhibitedthetrendofrise-fall-riseagainduringthestressprocess.Intermsofdigestiveenzymes，LPSac-tivityoflarvalL.calcariferfrom5mg/Lexperimentalgroupwassignificantlylowerthanthecontrolgroupafter36hofstress，butthegroupof10mg/Lexhibitedthetrendofincrease-decrease-increase-decreasesince12hofstress.AMSactivityoflarvalL.calcariferinexperimentalgroupsof5and10mg/Lexhibitedthetrendoffall-rise.TRYPactivityofthefishfromexperimentalgroupsof5and10mg/Lexhibitedriseandfallalternately.【Conclusion】AmmonianitrogenstressgreatlyaffectsthedigestiveenzymeandantioxidantenzymeoflarvalL.calcarifer.LarvalL.calcariferexhibitsacertaintolerancetoammonianitrogenwithinshorttime（<6h）.SomeantioxidantenzymesoflarvalL.calcarifersuchasSOD，CATinducesunderthedramaticchangesofammonianitrogentoeliminateexcessivefreeradicals.Digestiveenzymeactivi-tiesexhibitsdifferentrisinglevelsinordertoreplenishtheenergyconsumption.

Keywords：Latescalcarifer；larvalfish；ammonianitrogenstress；antioxidantenzyme；digestiveenzyme

0引言

【研究意义】氨氮是养殖环境中重要的水质指

标，一般分为离子氨和非离子氨两大类（刘洪展等，2012）。非离子氨在低浓度下即会对鱼类产生较强的毒性作用，而离子氨的毒性相对较小（龙章强，2008）。大多数硬骨鱼类对非离子氨非常敏感，当其浓度大幅度超标时会直接损伤鳃组织，渗透进入血液淋巴组织，影响机体呼吸及免疫功能（deFreitasRebeloetal.，2000；Kooetal.，2015），甚至引起发病死亡（Benlietal.，2008）。氨氮是引发鱼病的主要环境因子，当鱼类个体受氨氮刺激尤其在超出其可调节阈值时，机体抗氧化酶系统受损，鳃、肾脏及肝脏组织结构发生病变，机体呼吸及排泄系统将遭到破坏，进而影响机体的正常生理功能（王琨，2007）。因此，研究氨氮胁迫对水产动物生理指标及组织结构的影响，可为胁迫因子对机体的影响监测提供基础指标及明确鱼类对氨氮的耐受性，对促进水产养殖可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外学者已开展大量关于氨氮胁迫对水生生物影响的研究，如栉孔扇贝（Chlamysfarreri）（樊甄姣等，2005）、中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）（洪美玲等，2007）、奥尼罗非鱼（Oreochromisniloticus×O.areus）（韩春艳等，2014）、黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）（黎庆等，2015）等。不同水生生物对氨氮的耐受能力不同，同一物种不同规格及不同地理群体的氨氮耐受性也存在差异（王贞杰等，2017）。黄鹤忠等（2006）研究发现，随氨氮胁迫浓度的增加和胁迫时间的延长，中华绒螯蟹非特异性免疫防御系统遭受损伤的同时，其机体清除自由基的能力下降，导致细胞或组织受到伤害甚至出现死亡。邱德全等（2008）研究表明，高浓度的氨氮对凡纳滨对虾（Litopenaeus

vannamei）影响显著，可致使对虾血细胞数减少，抗病酶活指标下降，进而严重影响噬菌体清除副溶血弧菌的效果，提示以噬菌体防治对虾弧菌病必须在水质条件良好的前提下才能发挥作用。强俊等（2011）探讨了氨氮和养殖密度对吉富罗非鱼幼鱼生长的联合影响，结果表明，氨氮浓度为0.02~0.20mg/L，养殖密度在1~2尾/10L时，幼鱼特定生长率较高；氨氮浓度高于0.20mg/L，养殖密度为3尾/10L左右时，生长速度较快。可见，氨氮胁迫下机体抗氧化系统受到严重干扰，鳃、肝脏及肾脏组织结构受损，显著影响个体消化酶活力，进而影响个体的生长与存活（艾春香和曾媛媛，2011；任海等，2014；李利红等，2015；王程昊等，2017）。因此，在实际生产中可通过加注新水或充氧等方式，降低非离子氨的毒性，以减少集约化养殖中氨氮胁迫的发生概率。【本研究切入点】尖吻鲈（Latescalcarifer）俗称金目鲈或红目鲈，隶属于鲈形目（Perciforme）鲈亚目（Percoidei）尖吻鲈科（Latidae），为暖水广盐性和降海产卵鱼类（Guiguenetal.，1994），广泛分布于印度及西太平洋地区（赵旺等，2017）。尖吻鲈生长迅速、肉质细嫩、口感鲜美，且养殖周期短，已成为热带、亚热带地区网箱和池塘养殖的热门鱼种（莫介化等，2002；孙典荣等，2012）。目前，国内外针对尖吻鲈的研究主要集中在人工繁育（杜涛等，2010）、营养成分分析（李卓佳等，2011）、分子标记（Wangetal.，2011；Newtonetal.，2012）、捕食动力学（RobeiroandQin，2015）等方面，而鲜见有关环境胁迫的研究报道。【拟解决的关键问题】研究氨氮急性胁迫下尖吻鲈稚鱼多种抗氧化酶和消化酶的变化规律，明确氨氮对其存活与生长的影响机制，为提高尖吻鲈仔、稚鱼养殖存活率

10期刘亚娟等：急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶及抗氧化酶活性的影响

·2089·及丰富尖吻鲈养殖生态学理论提供依据。

1材料与方法

1.1

试验材料

尖吻鲈受精卵由中国水产科学研究院南海水产研究所海南热带水产研究开发中心自行催产获得，受精卵于27.5℃水箱中平衡20min后轻缓倒入500L的玻璃纤维孵化器中孵化和暂养。养殖用水参数：温度（29.0±1.0）℃，pH8.0~8.2，盐度（33.0±0.8）‰，溶氧≥6.5mg/L，亚硝酸盐<0.03mg/L，氨氮<0.01mg/L，每日换水2次，每次换水10%，光照强度调至2000lx。2日龄起投喂轮虫（Brachionusro-tundiformis），轮虫密度10~20ind/mL直至9日龄4.50±0.10mm），7日龄起混合投喂卤虫无节幼体20~30ind/mL），轮虫密度不变直至15日龄。生物饵料需进行营养强化后进行投喂，强化剂品牌为S.presso（INVEAquaculture，SaltLakeCity，UT，USA）。投喂轮虫时加入海水拟微球藻（Nannocho-loropsissp.青岛宏邦生物科技有限公司），以保证饵料充足及水体环境良好。每日定时清理排水口过滤网及育苗桶中的剩余饵料和排泄物。1.2试验设计

正式试验开始前先进行预试验，将分析纯NH4Cl配制成不同浓度的溶液，观察尖吻鲈稚鱼的行为及存活状况，以获得96h100%死亡质量浓度96h-LC100）并确定NH4Cl浓度上限。本研究采用96h半静水毒性试验法。为消除不同批次间的差异，试验鱼均来自同批受精卵且不重复使用，体长17.61±1.45mm。试验用水为过滤的海水，其参数与养殖用水相同，试验过程控制pH在8.1并停止投食。参照龙章强（2008）的研究方法，设0（对照）、5和10mg/L共3个氨氮浓度梯度组，每组3个平行（养殖容器），每个容器（50L）内投放120尾15日龄健康尖吻鲈稚鱼，分别于0、6、12、24、36、48、72和96h随机取样5尾。同时，每隔3h从各容器中收集水样，及时调整至设定氨氮浓度。试验过程中定时观察记录尖吻鲈的中毒症状、存活率及生理活性状况，其中死亡判断标准为鱼鳃停止煽动超过15s即视为死亡。1.3样品处理

各试验组所取样品（尖吻鲈稚鱼）吸干体表水分后称量体质量，然后与0.2mol/L生理盐水按指定比例进行研磨，研磨液在2.0℃下15000r/min离心10min，取上清液，-80℃保存备用。各消化酶及抗氧化酶活性均采用相关试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行测定，酶活性以U/mg或U/g表示。1.4

统计分析

试验数据采用SPSS19.0进行分析，先对试验数据进行单因素方差分析（One-wayANOVA），若不同处理组间存在显著差异，再进行Duncan?s多重比较。

2结果与分析

2.1急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼行为及存活率的影响

在各氨氮处理组中，随氨氮含量的升高，尖吻鲈稚鱼呈现出一定的应激行为，临床表现为狂躁不安、呼吸急促及痉挛，鳃盖煽动频率加快、局部充血及体表黏液分泌增多等；胁迫12h左右时稚鱼活动缓慢，失去躲避能力，但经24h适应后5mg/L处理组个体基本恢复正常，10mg/L处理组的应激程度减弱。10mg/L处理组个别个体出现体色变淡现象，并于胁迫48h后出现死亡个体，死亡鱼体僵硬弯曲、背鳍胸鳍张开，鳃盖及口裂亦剧烈张开，至试验结束时的存活率为99%；其余两处理组的尖吻鲈稚鱼存活率均为100%。

2.2急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼抗氧化酶活性的影响

2.2.1超氧化物歧化酶（SOD）活性由图1可知，不同氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性变化趋势存在明显差异。其中，5mg/L处理组稚鱼SOD活性在胁迫6~24h显著低于对照组（P<0.05，下同），于胁迫24h时达最低值，胁迫24~36h迅速上升至最高值，胁迫36~48h酶活性略有下降，此后趋于平稳，从胁迫36h起尖吻鲈稚鱼SOD活性始终高于对照组；10mg/L处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性呈下降—上升—下降—上升—下降的变化趋势，除胁迫72h外，３其他时间点均低于对照组。

３５０００．．０００００５　ｍｇ／Ｌg）myti２２５０．００v１０５００．００ａａ１　０ｍ　ｍｇ／ｇＬ／Ｌａ/itａａ性（Uca活DDO１０ｂ５０．０．０００ａｂｃｃｂａｂｂｃｃｂａａｂｂｂｂOSｃS０．．００００００６１２２４３６４８７２９６胁迫时间（h）Stresstime图1急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼SOD活性的影响

Fig.1EffectsofacuteammonianitrogenstressonSODactivi-tiesoflarvalL.calcarifer

同一胁迫时间点不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）。图2~图8同

Differentlowercaselettersatthesamestresstimerepresentedsignifi-cantdifferencebetweendifferentexperimentgroups（P<0.05）.ThesamewasappliedinFig.2-Fig.8

（（密度（