锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制动力学研究 

锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制动力学研究

以锯缘青蟹（Scytta Serrata

）内脏为材料,通过含0.2 mol/LNaCl的0.01

Sephadex G-100凝胶

mol/LTris-HCl（pH 7.5）缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、

柱过滤层析、DE-32离子交换柱层析,分离提纯NAGase（NAGase）,获得比活力为7,990U/mg的电泳单一纯NAGase制剂（NAGase,EC 3.2.1.52）。本文以此酶制剂为对象展开以下几方面的研究。

研究过氧化氢对锯缘青蟹

NAGase活力的影响及抑制动力学。其结果表明

,

过氧化氢对该酶有显著的抑制作用,随着过氧化氢浓度的增高,酶活力呈指数下

降,测出可使酶活力下降50%的过氧化氢浓度(抑制半衰期,IC₅₀)为0.115 mol/L。

低浓度过氧化氢对该酶的抑制过程显示为可逆效应。法研究过氧化氢对该酶的抑制作用动力学、

采用底物反应动力学方

建立动力学模型,测定游离酶（E）和

酶-底物络合物（ES）的微观抑制速度常数k₊₀和K′₊₀并加以比较。

实验结果(k₊₀＞k′₊₀)表明底物对酶被过氧化氢的抑制作用有一定的保护作用。过氧化氢可能是通过氧化酶活性中心功能基团而导致酶活性的丧失。

该研究对了解NAGase的功能基团性质及酶的催化作用机理提供重要的实验基础。研究脲对酶的效应,结果表明,脲对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）有失活作用,随着脲浓度的增大,酶活力呈指数下降,测定导致酶活力下降50%的脲浓度(失活半衰期,IC₅₀)为0.63 mol/L。

酶在脲溶液中的失活过程显示为可逆失活。用底物反应动力学方法考察酶在

脲溶液中的失活动力学,测定游离酶（E）和酶-底物络合物（ES）在脲溶液中失活的微观速度常数,并比较游离酶（E）和酶-底物络合物（ES）的正向反应的微观失活速度常数,表明底物存在对酶被脲的失活作用有一定的保护作用。

正向的失活速度常数k₊₀和k′₊₀随着脲浓度的增大而增大,而逆向的速度常数k_-0随着脲浓度的增大而减小。表明随着脲浓度的增大,酶变性越来越快,而活力恢复越来越难。

研究十六种氨基酸对酶的效应

,结果表明:非极性氨基酸中Gly、Ala、leu、

Phe对酶活力几乎没有作用,Val、Ile对酶略有激活,Val浓度为20 mmol/L使酶活力提高7.5%,Ile浓度为40 mmol/L,使酶活力提高10.5%。Pro,Met对酶活力略有抑制作用,当Pro浓度为40 mmol/L时分别使酶活力下降15.2%,当Met浓度为40 mmol/L时分别使酶活力下降9.8%.极性氨基酸Asn、Cys、Ser、Thr对酶的活力没有影响。

带负电荷的酸性氨基酸Asp和Glu对酶有抑制作用,当Asp浓度为40 mmol/L时,使酶活力下降38%;当Glu浓度为40 mmol/L时,可使酶活力下降25%。带正电荷的碱性氨基酸His略有抑制,Lys和Arg抑制作用较强,研究Lys和Arg对酶催化pNP-NAG水解反应的抑制机理,并测定其抑制常数,结果表明Lys和Arg的对酶的抑制均表现为可逆效应,抑制类型均为反竞争性抑制,其Kis分别为5.29 mmol/L和3.76 mmol/L。

研究对-氯汞苯甲酸（pCMB）对NAGase的化学修饰作用,巯基是酶活性的必须基团。氯化汞对锯缘青蟹

NAGase抑制动力学研究,结果证明:当汞离子浓度小

,汞离子对酶的抑

于1.0 lamol/L时,汞离子对剩余酶活力的作用表现为可逆反应制机理属于竟争性抑制类型。

通过汞离子对酶抑制作用的动力学模型的建立络合物（ES）在氯化汞溶液中失活的微观速度常数

,测定游离酶（E）和酶.底物,研究汞离子浓度与表观速度

常数之间的关系,结果证明:仅一分子氯化汞结合到酶分子活性中心就可导致酶活性的丧失。实验结果提示半胱氨酸残基位于酶活性中心

,是酶分子的必须基团。