碱裂法小规模提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳

碱裂法小规模提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳

一．实验原理

碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离目的。在碱性条件下，线性大分子细菌染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构互补链变性解开。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当用pH4.8的NaAc高盐缓冲液调其pH值至中性，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中为可溶状态。而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心将细胞碎片，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来被除去，质粒DNA及部分RNA，蛋白质则存在于上清中，再用RNaseA 处理，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀而获得质粒DNA。

质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。天然的质粒都是环状双链DNA，大小从5kb到400kb不等。质粒虽然独立于染色体外自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码的酶和蛋白质复制因子。质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有1～5拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10～200个，甚至更多拷贝。 1.质粒的结构：

(1)抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)

(2)启始复制子（ori, Origin of replication)；

(3)多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker) 2.细菌裂解的方法：

（1）碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS （2）煮沸裂解法:沸水煮沸40秒

（3）SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。 DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。琼脂糖凝胶适用于200bp—50kp的DNA分子或片段的分离，琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用荧光染色。在紫外光照射下，可以确定DNA的位置。 DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。

二．实验仪器及试剂 1．溶液1：

50mmol/L葡萄糖，

10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。

2．溶液2－0.2mol/L-NaOH, 1%SDS 3．溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O

4．饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) 5．氯仿

6．3M乙酸钠溶液(pH5.2) 7．TE缓冲液:

10mmol/L，Tris-HCl,

1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 8．100%乙醇与70％乙醇

9．台式高速离心机，漩涡振荡器

10．水平板型电泳槽，直流稳压电泳槽及梳齿，紫外分析仪。电泳级琼脂糖（Agarose），电泳缓冲溶液（1*TAE），荧光染色剂，10X加样缓冲液

三．实验步骤

1．质粒小量提取的方法： （1）培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时;

（2）取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100?l溶液I，充分混匀;置冰上; （3）加入200?l新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（溶液II ），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置2--3min;

（4）加入150 ? l乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min; （5）用台式高速离心机，12000r/min离心10min，上清移入另一干净离心管，并加3ul RNaseA, 37C保温45min;

（6）上清中加入等体积的酚/氯仿抽提一次,等体积氯仿抽提一次;每次均要振荡—离心(10000rpm离心1min) —吸取上清到新的离心管中;

（7）上清中加入1/10 体积3M乙酸钠溶液(pH5.2) ,和2.2倍体积的无水乙醇,混匀后-20℃保存。

（8）12000rpm 离心20分钟，弃去上清，沉淀加入1ml 75％乙醇洗涤， 12000rpm 离心2分钟，彻底弃去上清，真空干燥或烘干。 （9）沉淀溶解于30ul TE溶液，取10ul 电泳检查 2．琼脂糖凝胶电泳

（1）电泳体系：1％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液：1 × TAE （由50 × TAE稀释），电泳方式：稳压，<5/cm

（2）100ml 1％琼脂糖凝胶配制方法：

100 ml 1 × TAE 溶液中加入1克琼脂糖 （3）染料：GoldView DNA染料（上海赛百盛公司），染料用量：5ul/100ml凝胶 （4）显色：紫外灯下，双链DNA呈绿色，单链DNA呈红色 3．电泳操作步骤

1、称取1克琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入100ml*TAE溶液，加热至完全溶化。

2、将凝胶液冷至50℃左右。

3、将制胶板槽的两端用胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已，使之形成均匀水平的胶面。 4、.待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在槽内加入1*TAE溶液，至液面覆盖过胶面

5、把待检测的样品，在洁净载玻片上小心混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。 6、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

7、观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至适当位置处，可停止电泳。 8、把胶槽取出，小心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上。 9、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm或254nm），通过观察孔进行观察。

四．实验结果 所得电泳图见下图

其中，第三条带即3.3kb的双链环状质粒DNA，这条带越亮则实验效果越好。不同的构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢为环状DNA。

五．实验注意事项

1)细菌过量将影响溶菌及质粒DNA的释放。

2)在步骤3和步骤4中操作必须温和。剧烈摇晃，将导致基因组DNA的污染。但混合必须充分，否则影响得率。 3)在加入溶液Ⅲ时，蛋白质和基因组DNA形成粘稠的白色絮状沉淀，必须充分摇晃混合均匀，使凝集块中间也得到充分中和。若离心后凝集块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转混合数次，最高速度离心3 min。

4)电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。

5)加样进胶时不要形成气泡，需在凝胶液未凝固之前及时清除，否则，需重新制胶。

6)以0.5×TBE作为电泳缓冲液时，溴酚兰在0.5%～1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于300bp的线性DNA的泳动速度，而二甲苯青FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度