7.每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期？各期细胞有何特点？
答：每代细胞从开始接种到分离再培养，一般要经过以下阶段：潜伏期、指数(对数)生长期和停止期(平台期)。 ①细胞接种培养初期，历经悬浮、贴壁及生长加速的阶段。细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，贴壁出现标志悬浮期结束。细胞贴附于支持物后，会发生一系列变化，然后还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有生长活动，基本无增殖，少见分裂相。潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，标志细胞进入指数生长期。 ②又称对数期。此时细胞生长增殖旺盛，细胞成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞分裂相增多。细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。） ③在细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停止期。此时细胞数量持平，故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，可继续存活一段时间。该时期细胞形态轮廓增强，最后开始衰退死亡。
8.什么是原代培养与传代培养？原代细胞培养有哪些方法？各自的适用范围是什么？ 答：原代培养也称初代培养期，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续 1～4 周。 传代培养是指原代细胞生长一定时间后， 如是贴附型细胞就会连接成片而铺满瓶底， 这时需将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程称为传代，初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。（课本54页）原代细胞培养的方法有：组织块培养法、单层细胞培养法、悬浮细胞培养法。组织块培养法特别适合于组织量少的原代培养；单层细胞培养法尤其适用于细胞建系和大量组织的培养，用于少量培养工作时稍显繁琐；悬浮细胞培养法对悬浮生长的细胞如白细胞、骨髓细胞和胸水、腹水等癌细胞，可直接接种进行原代培养。 9.常用的组织细胞分离方法有哪几种？
答：分散组织的方法有机械法分离和消化分离法两种；根据组织种类和培养要求，宜采用相应的方法。(1). 机械分离法：A.离心分离法 B.切割分离法 C.机械分散法；(2). 消化分离法：A.胰蛋白酶 消化法 B.胶原酶消化法 C.EDTA（螯合剂消化法 10.贴壁细胞传代时采用何种方法？其技术关键是什么？
答：贴壁细胞传代时采用消化分离法，其技术关键是把握好传代时机，消化时间要适度，消化液浓度要适宜，传代的细胞接种数量可适当多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖， 部分贴壁生长细胞不经消化处理直接进行吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。
11.常用的动物细胞大规模培养主要有哪些操作模式？各有哪些优缺点？
答：操作模式：可采用分批式操作、流加式操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作等多种操作方式进行培养。
分批式操作：将细胞扩大培养后，一次性将细胞和培养液投入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其他成分，待细胞增长和产物积累到适当的时间，一次性对细胞、产物、培养基进行收获，从中分离所需物质。该操作简单、培养周期短、污染和细胞突变的风险小，既能直观地反应细胞生长代谢的过程，又可直接放大，是进行动物细胞培养工艺条件研究常用的手段。
流加式操作：细胞持续生长至较高的密度，整个培养过程没有流出或回收，细胞或产物达到所需指标后终止培养，一次性回收整个反应体系，分离纯化产品。
半连续式操作：培养物的体积逐步增加；可进行多次收获；细胞可维持指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可持续到很长时间。
连续式操作：细胞维持持续指数增长，产物体积不断增长，可控制衰退期和下降期。其不足是，由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染，在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异，对设备、仪器的控制技术要求较高。
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灌流式操作：细胞截留系统可使细胞保留在反应器内，维持较高的细胞密度，提高产品的产量；连续灌流细胞使细胞稳定地处于较好的营养环境中，有害代谢废物得以及时清除；反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；产品在灌内停留时间短，可及时回收，有利于保持产品的活性。 12.什么是细胞系、细胞株？ 答：细胞系 (cell line): 原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。如果细胞系不能继续传代或传代次数有限，称为有限细胞系，它由原代培养中的许多细胞系列组成；如细胞系可连续传代，则称为连续细胞系，即已建成的细胞系。 细胞株 (cell strain)：通过筛选或克隆化，且有特异标记的细胞，这些特性在以后的培养中必须持续存在。 这些特性包括具有一定的标记染色体， 对某种病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。
13.简述细胞融合技术的主要方法与技术原理。 答：促细胞融合的方法有：病毒融合剂诱发细胞融合，化学融合剂诱发细胞融合，电融合法。细胞融合的基本技术：细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞并列，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。融合细胞表现的特征性变化，有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。
14.简述筛选融合细胞的主要方法与原理（各种方法的原理？）
答：利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为等标志，建立了多种选择系统，最常用的是酶缺陷型HAT选择培养法。
酶缺陷型：将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。因此存活下来的只有融合细胞。 营养缺陷型：营养缺陷型是指一些细胞在合成某些营养物上有缺陷，在缺乏必须营养物的培养基中难以生存。将不同营养缺陷型的细胞生成杂交细胞，这些细胞通过融合后基因互补得以在缺乏相应营养物的培养基中得以生存，而未融合细胞由于代谢受阻而死亡，由此可以将融合细胞分离出来。
温度敏感性：利用突温度敏感性：培养的哺乳动物细胞可在32℃～40℃之间的范围内存活（最适温度为 37℃）变获得不能在非许可温度(如38℃～39℃)中生长的温度突变型细胞， 利用与温度敏感突变细胞融合的杂交细胞，采用非许可温度下进行选择培养，就可将融合的杂交细胞筛选出来。
形态和行为标志：形态和行为标志：若亲本细胞形态明显不同，识别异核细胞并不困难。例如，鸡红细胞与 HeLa 细胞融合，它们的核不仅大小和形态不同，而且鸡红细胞的核相当浓缩；HeLa 细胞核染色质则比较 弥散。由这两种细胞融合产生的异核细胞，就很容易鉴别。利用细胞生长或贴壁行为不同的特点，也可用来筛选杂种细胞。例如，鸡红细胞离体时不再生长，但可与其它细胞(如 HGPRT－的人细胞) 杂交。在 HAT 培养液中，HGPRT－细胞死亡，鸡红细胞也不生长，只有杂种细胞增殖。
15.简述单克隆抗体的制备过程及主要原理。针对某一抗原物质A设计一个研究方案，并制备相应的单克隆抗体。
答：原理：在体液免疫反应中，一个抗原分子上可能含有许多抗原决定簇(即表位)，每个淋巴细胞都会产生针对一个抗原决定簇的特异性抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。大量培养此细胞株， 即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。
基本过程：先免疫动物，分离脾细胞，准备骨髓瘤细胞的准备，细胞融合，筛选与克隆融合细胞，最后大量制备单克隆抗体。
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方案：免疫动物：将处理好的抗原多次注射到 BALB/c 小鼠体内，每隔2天注射一次，第3~5 天进行试采血检验血清中的抗体，同时可用脾内注射培养基轻轻挤压使淋巴细胞逸出的方法采集淋巴细胞（大多为B细胞） 细胞富集：将抗原包被在培养板或其他基质上，然后与脾细胞结合，那些表面具有特异性抗体的B细胞与抗原结合使得B细胞黏附于培养板或基质上，轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞为具有特异性抗体的B细胞 骨髓癌细胞的准备：用BALB/c 小鼠的 653。 细胞融合：用 PEG 诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞间进行融合，操作在 10 min 内完成； 融合后马上以 HAT 培养，能活下来的大多为B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。未融合的骨髓瘤及骨髓瘤细胞间相互融合的细胞在HAT中因 DNA 合成抑制而死亡。未融合的B细胞及B细胞相互融合的细胞在体外培养因无法增殖会渐渐死去。 使用抗原结合法对杂交瘤细胞产生的抗体专一性进行筛选采用有限稀释法或软琼脂法对杂交瘤细胞进行细胞克隆化，获得来自单个细胞的克隆；并对单个细胞生长出的群落，再次以 ELISA 筛选专一性抗体，获得可产生特异性抗体的单克隆细胞株。用体内法大量制备单克隆抗体：可把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，诱导小鼠产生大量腹水，然后以针头收集所产生的腹水，通常每次可取得 3～5 mL 左右。 16.HAT 的选择原理是什么？
答：HAT 系统为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的缩写。它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞特殊的培养基。 细胞内核苷酸的生物合成有两条途径： 一条是主要途径，该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA 的合成；另外一条是补救途径，该途径需要两种酶参与。一种是HGPRT酶(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)，另一种酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶) 。它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。H、T 为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。在氨基喋呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP 的途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”依赖外源来合成核苷酸。因此，一个 HGPRT－或 TK－的细胞株不可能在含HAT的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞相融合，则杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外长期生存的骨髓瘤细胞系，而另一个亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。如将长期培养系突变为HGPRT 或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。因此存活下来的只有融合细胞。
17.利用细胞工程制备人源性单克隆抗体的方法主要有哪些？它们的优势与难点何在？ 答：主要有：EB病毒转化技术，人－鼠杂交瘤单克隆抗体，人－人杂交瘤单克隆抗体，利用基因组工程构建转人Ig基因组小鼠，严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体。
优势和难点： 1、利用类似于疱疹病毒的 EB 病毒在体外直接感染人外周血淋巴细胞，使之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系，这些细胞可在体外分泌人抗体。2、人－鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分泌抗体的能力。3、人－人杂交瘤单克隆抗体可供利用的人骨髓瘤细胞种类非常有限，人的骨髓瘤细胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞，而且人不能像小鼠那样进行高度免疫，B淋巴细胞常限于取自外周血(小鼠取自动物脾脏)，激活状态不适合做融合；故人－人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛 选以及融合细胞分泌抗体方面仍不理想。4、基因组工程构建转人Ig基因组小鼠：改造过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位的三个互补决定区(CDR)是鼠源的以外，其余部分均是人源的。以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体，但获得的是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较大，但已有成功的报道。5、严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体内，SCID小鼠获得了人的免疫系统。这
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种小鼠可用任何抗原免疫，从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞，进一步进行细胞融合或制备抗体库
18.简述单克隆抗体在临床诊疗中的应用。
答：理论研究，构建B淋巴细胞杂交瘤可用于分析B细胞的多样性及其产生机理，并能分析免疫应答中抗体的多样性。利用单克隆抗体可进行表位分析：利用单克隆抗体的交叉反应，能帮助找出大分子之间在重要结构和生物学上的关系， 因为对一种单克隆抗体起反应的几种大分子一定具有相同和相似的抗原决定簇。
诊断试剂中的应用，针对 HIV、乙肝等疾病的单克隆抗体，测定妊娠的hCG 单克隆抗体、测定排卵的LH单克隆抗体在市场上大量供应。 19.什么是转基因动物？
答： 转基因动物 (trnasgenic animal)：是指借用基因工程技术将外源基因导入动物染色体内，使外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在动物体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。
20.制备转基因动物有哪些主要方法？简述其主要原理和技术过程。试比较这些方法的优劣。
答：生产转基因动物的方法主要有原核(显微)注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体导入法、细胞核移植法等，应用较多的方法为原核（显微）注射法。 显微注射法： 基本原理——通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内， 使使外源基因整合到 DNA 中，发育成转基因动物。步骤：①目的基因的制备与纯化；②卵供体母体和假孕母体的准备；③超排卵与取卵；④基因显微注射；⑤受精卵移植；⑥目的基因的表达整合鉴定和检测；⑦建系。优点：外源 DNA 分子大小基本不受限制，外源 DNA 在宿主动物染色体上整合率高，方法相对简单，导入直观。但利用 DNA 显微注射法得到的转基因动物都是随机整合的，用该方法很难得到同源重组动物。 逆转录病毒法；P143 胚胎干细胞转导法；P1453精子载体法；P144 细胞核移植法 P144 21.简述细胞核移植技术的主要类型及其主要操作技术 答：细胞核移植是指通过显微操作的方法，将供体细胞的细胞核放入预先去核的成熟卵母细胞或早期合子内，形成一个新的核质重组体，移入的核在受体胞质的作用下，发生发育程序重编，使得核质重组体与正常受精卵一样，经细胞分裂、分化并在母体内发育成一个新的个体。
依据供体细胞类型分为：胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、体细胞核移植；依据供体细胞与受体卵母细胞的来源分为：同种核移植、种间核移植。
主要操作技术：1.受体卵母细胞的准备：超数排卵、活体采卵、屠宰后母畜卵巢上采卵（体外成熟）2.供体细胞的准备：16-32 期胚胎、供体卵裂球。3.卵母细胞的去核与注射 4.重组胚的融合：构建的重组体用直流电脉冲进行电融合 5.重组胚的激活：电激活、乙醇激活、钙离子和钙离子载体激活、离子霉素激活、Sr2+ 激活 6.重组胚的培养与胚胎移植。 22.讨论核移植技术的应用现状及其发展前景？
答:1.体细胞克隆在生产转基因动物和医学领域的应用;2.体细胞克隆技术在农业生产中的应用;3.商业性克隆动物;4.体细胞克隆在珍稀、濒危动物保护中的应用;5.体细胞克隆在人类再生医学上的应用;6.体细胞克隆在基础研究中的应用 23.分析影响动物核移植成败的关键因素。
答：影响体细胞核移植成功率的因素有：供体细胞的因素；受体卵母细胞的因素；核移植方 法的影响；激活方法的影响；体外培养系统的影响；受体动物管理及胚胎移植的影响；新生 动物护理及管理的影响。
24.什么是胚胎工程？其主要内容包括哪些？
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