山东东南沿海绿茶成分的UHPLC-MS分析

山东东南沿海绿茶成分的UHPLC-MS/MS分析

房泽海 药学系

摘要：本文采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS/MS）分别对5种山东东南沿海绿茶进行了定性和定量分析。茶叶样品粉碎后经50 %甲醇(v/v)超声提取，提取液进样分析，采用Hypersil GOLD C18 色谱柱分离，以0.05 %甲酸水和乙腈为流动相梯度洗脱。测定了几种山东绿茶中7种儿茶素类化合物的含量，并鉴定和推测出了其中的24个化合物。5种山东绿茶的儿茶素组成基本一致，只是含量上有差异，山东朱芦中EGCG、EGC、GC、EC、C和ECG的含量均高于另外4种绿茶，而GCG的含量在山东巨峰中最高；同时，在推测和鉴定出的24个化合物中还包括两种原花青素二聚体，这在文献中报道比较少。

关键词：山东绿茶；主要成分；UHPLC-MS/MS

茶叶的品种繁多，命名复杂。以制法为基础，结合品质特点和外形差异可将茶叶分类为：绿茶、黄茶、白茶、青茶、红茶、黑茶等几大类。绿茶作为我国产量最大的茶类，属于不发酵茶，因此较多地保留了鲜叶中的天然物质。茶多酚是茶叶中的主要活性成分，主要包括黄烷醇、黄烷双醇、类黄酮及酚酸四大类物质。儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，约占茶多酚总量的60%～80%。主要的儿茶素有7种，分别是表没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-epigallocatechingallate, EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-gallocatechingallate,GCG）、表儿茶素没食子酸酯（（-）-epicatechingallate, ECG）、表儿茶素（（-）-epicatechin, EC）、儿茶素（（+）-catechin,C）、表没食子儿茶素（（-）-epigallocatechin, EGC）及没食子儿茶素（（-）-gallocatechin, GC），其中EGCG含量最高。研究表明，茶多酚具有多种保健功能和药理效应，如抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、降血脂、防治动脉硬化等

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超高效液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS/MS）结合了质谱灵敏的结构鉴别和分析能力以及液相色谱强大的分离能力，可提供准确、可靠的相对分子质量及一些结构信息，充分简化了实验程序，节省了时间，它作为目前最重要的分离及鉴定方法之一，在各个领域中发挥着无法取代的作用。本文采用了UHPLC-MS/MS技术对山东东南沿海5种绿茶中的主要化学成分进行了定性分析并对儿茶素类化合物的含量进行了测定。

1 材料与仪器

1.1 材料

5种山东绿茶（朱芦、洙边、巨峰、后村和虎山；2014年产）分别采购于山东省临沂市莒南县朱芦镇、山东省临沂市莒南县洙边镇环河崖村、山东省日照市岚山区巨峰镇、山东省日照市岚山区后村镇和山东省日照市虎山镇。

1.2 试剂

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）购自德国Merck公司；甲酸（色谱纯）购自美国ROE科技公司；超纯水来自于Milli-Q净化系统（美国Millipore公司）。7种儿茶素对照品EGCG 、GCG、EGC、GC、EC、C 和ECG (纯度均>98%)购自上海同田生物技术有限公司。 1.3 仪器

Allegra 64R高速冷冻离心机（BeckmanCoulter有限公司，美国）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TSQ Vantage 三重四极杆液相色谱-质谱联用仪（ThermoFisher科技公司，美国），包括UltiMate 3000 UHPLC、自动进样器、柱温箱及TSQ质谱仪；LTQ Orbitrap XL 液相色谱-质谱联用仪（Thermo Fisher 科技公司，美国），包括UltiMate 3000 UHPLC、自动进样器、柱温箱及LTQ Orbitrap XL系统。

2 实验方法

2.1 样品处理

取200 mg粉碎的茶叶样品，加入1mL 50%甲醇，37℃水浴超声提取30min，13000r/min离心10 min；离心后，取200μL上清液，用甲醇稀释到1 mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后备用。

2.2 茶叶中儿茶素含量的测定

取100 μL 经“2.1样品处理”处理后的样品，用TSQ三重四极杆进行定量分析。 2.2.1 儿茶素对照品溶液的配制和标准曲线的绘制

精密称取7种儿茶素对照品（GC、EGC 、C 、EC、EGCG 、GCG、ECG）适量，各自配制成浓度分别为1、5、10、20、100、125、250μg/mL的对照品溶液。以峰面积(Y)对浓度（X）绘制标准曲线，得到线性回归方程和相关系数（表1）。

表17种儿茶素定量分析的线性回归方程和相关系数

Table 1 Regression equation and correlation coefficient (R) of determination of seven catechins Catechins EGCG GCG EGC GC

Regression equation Y=882539X+4000000 Y=781300X-78822 Y=726600X+2000000 Y=767591X+2000000

R 0.9996 0.9946 0.9993 0.9995

EC C ECG

Y=526922X-514775 Y=755428X+2000000 Y=652233X+6000000

0.9994 0.9983 0.9991

2.2.2 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18（2.1 mm×50 mm; 1.9μm）。流动相A：0.05%甲酸-水溶液；流动相B：甲醇。流速：0.30 mL/min；进样量：5μL；柱温：35.0±1.0℃。线性洗脱梯度：0–1.0 min , 10% B；1.0–7.0 min, 10–30% B； 7.0–7.5 min, 30-70% B；7.5-8.0 min，70% ；8.0-8.5 min,70-10%； 8.5–10.5 min, 10% B。 2.2.3质谱条件

加热电喷雾电离源（H-ESI）；负离子检测模式；喷雾电压：3000V；离子源温度：450℃；毛细管传输温度：350℃；鞘气压力：45 Arb；辅助气压力：25 Arb。碰撞能量(CE)：27 V（EC/C）,21 V（EGCG/GCG）,24 V（EGC/GC）和23 V（ECG）。扫描模式为选择反应监测（SRM）：EC/C,289.019→109.073；EGCG/GCG

,457.035→169.016；

EGC/GC ,305.013→125.060；ECG，441.030→169.034。数据处理：Xcalibur工作站。

2.3山东绿茶主要成分的定性分析

取100μL经“2.1样品处理”处理后的样品，用LTQ Orbitrap进行定性分析。 2.3.1色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18（2.1 mm×100 mm; 3.0 μm）。流动相A：0.05 %甲酸-水溶液；流动相B：乙腈。流速：0.30 mL/min；进样量：5μL；柱温：40.0±1.0℃。线性洗脱梯度：0–2.0 min , 5% B；2.0–9.0 min, 5–28% B； 9.0–11.0 min, 28-90% B ；11.0-13.0 min，90% B ；13.0-15.0 min , 90-5% B ；15.0–18.0 min, 5% B。 2.3.2质谱条件

加热电喷雾电离源（H-ESI）；负离子检测模式；离子源电压：3.5kV；离子源温度：300℃；毛细管传输温度：300℃；鞘气压力：45 Arb；辅助气压力：10 Arb。m/z扫描范围：100-1000。数据处理：Xcalibur工作站。

3 结果与分析

3.1 山东绿茶中儿茶素类化合物的组成及含量

5种山东绿茶的儿茶素定量结果列于表2。从儿茶素类化合物的组成来看，5种绿茶很相似，都含有EGCG、GCG、EGC、GC、EC、C和ECG这7类儿茶素，只是含量不同；从儿茶素类化合物的含量上，5种绿茶中均以EGCG的含量最高，其次是EGC和ECG，7种儿茶素活性成分中C的含量最低。通过比较发现，山东朱芦中EGCG、EGC、GC、EC、C和ECG的含量均高于另外4种绿茶，而GCG的含量在山东巨峰中最高，由此反映了山东东南沿海五个不同地区的绿茶在儿茶素含量上的差异。

表2 5种山东绿茶中儿茶素类化合物的含量（mg/g）

Table 2 Contents of catechins in 5 kinds of Shandong green tea（mg/g）

品种 山东巨峰 山东洙边 山东虎山 山东朱芦 山东后村

EGCG 24.46±0.64 20.75±0.52 22.97±0.59 30.50±0.84 23.86±0.62

GCG 2.41±0.38 1.38±0.40 2.12±0.38 1.42±0.39 2.29±0.38

EGC 16.70±0.54 15.07±0.22 15.03±1.31 19.20±1.81 16.43±0.44

GC 1.93±0.28 1.09±0.06 1.89±0.10 2.49±0.18 2.09±0.17

EC 4.54±0.25 2.96±0.34 4.13±0.27 4.73±0.24 4.04±0.19

C 0.73±0.15 0.61±0.07 0.71±0.15 0.93±0.16 0.53±0.15

ECG 15.36±0.27 12.96±0.24 15.02±0.20 18.29±0.32 14.06±0.14

5种山东绿茶的总儿茶素含量（以7类儿茶素的含量之和计）如图1所示。整体来看，山东朱芦的总儿茶素含量在5种绿茶中最高，山东洙边最低；通过比较，总儿茶素含量的高低分别为山东朱芦＞山东巨峰＞山东后村＞山东虎山＞山东洙边。