一种阳离子去污剂，既能有效溶解植物的细胞膜，裂解细胞又能有效沉淀多糖，用于处理多糖成分较多的组织有独特的优点。CTAB还能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液(>0.7mol/L)中溶解，在低盐溶液中则沉淀析出，而大部分的蛋白质及多糖仍溶于低盐溶液中，为此，通过离心就可将这两类物质分开。然后将此复合物沉淀重新溶于高盐溶液中， 再加入乙醇， 此时CTAB溶于乙醇，而核酸沉淀析出，达到分离的目的。
DNA中如果含有酚类和多糖类物质会影响PCR的效果，DNA浓度也是一个关键因素，因此需要对DNA浓度、纯度和相对分子量等基本情况有所了解。紫外光谱分析是定性和定量检测DNA的有效方法之一，其原理基于DNA(RNA)分子在260nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比，该法特点准确、简便，但所需仪器较昂贵。所提取DNA的纯度可用OD260和OD280的比值来评判。OD260/ OD280 对DNA而言，大约为1.8，高于1.8可能有RNA污染，低于0.9时，可适当稀释样品。紫外分光光度法可以通过OD260和OD280 测出DNA的浓度和纯度，但不能区分DNA的超螺旋、开环、现状三种构型，也不能区分染色体DNA，其他DNA多数选用琼脂糖凝胶法进行鉴定。
1985年，美国Kary Mullis等利用一种耐热性聚合酶(Taq酶)首创了称为聚合酶链式反应的DNA体外扩增技术一PCR(polymerase chain reaction)。它利用体内DNA复制的原理，以合成的一对寡核苷酸片段为引物，在耐热Taq DNA聚合酶催化下经过几十次变性、退火、延伸的循环，使两段引物之间的DNA片段大量扩增。能在短时间内将不同生物材料DNA成指数递增而获得扩增产物带型的遗传多态性，从而使人们从DNA水平上鉴定物种的亲缘关系与进化地位成为可能。目前，PCR技术已广泛用于各个领域的研究工作，但遗憾的是标准PCR需要被测生物样品基因组的序列信息，并以此设计引物，这给大规模研究不同物种遗传多样性带来了一定的局限性。
简单序列重复区间（inter-simple sequence repeat，ISSR）分子标记在SSR标记基础上发展起来的一种新技术，由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等(1994)提出。其基本原理是在SSR的5’或3’端加锚十几个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。重复序列和锚定碱基是随机选择的，引物通常为16-18个碱基。扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比RAPD方法更多的扩增片段，因此，ISSR标记是一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的DNA指纹技术。ISSR标记呈孟德尔式遗传，在多数物种中是显性的，目前已广泛用于
植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。
三、
实验材料和仪器
1、 实验材料
山麦冬 Liriope spicata Lour. 湖北麦冬Liriope spicataLour.var.prolifera Y.T.Ma，短葶山麦冬Liriope muscari Bailey，川麦冬Ophiopogon Japonicus Ker-Gawl 用液氮研磨至细粉后，冷冻保存。
2、 实验试剂
RNase、Marker为100bp ladder（100 bp、200 bp、300 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1000 bp、1200 bp、1500 bp、2000bp、3000bp）购自北京鼎国昌盛有限公司， CTAB、Tris、EDTA、β-SH、溴化乙锭、RAPD和ISSR引物（详见下表）购自上海生工生物工程有限公司。异戊醇、氯仿等常规试剂均为分析纯。
RAPD所用引物
引物号 S01 S02 S03 S04 S06 S13 S25
3. 实验试剂的配制
1mol?L-1Tris-HCl(pH 8.0)：在80 mL水中溶解12.11g Tris碱(三羟甲基氨基甲烷)，加入浓HCl 4.2mL，溶液冷至室温后，调节pH，定容至100mL，高压灭菌。
碱基序列 CCT GGG CTT C CCT GGG CTT G CCT GGG CTT A CCT GGG CTG G CCT GGG CCT A CCT GGG TGG A ACA GGG CTC A
引物号 UBC807 UBC811 UBC815 UBC835 UBC842
ISSR所用引物
碱基序列
AGA GAG AGA GAG AGA GT GAG AGA GAG AGA GAG AC CTC TCT CTC TCT CTC TG AGA GAG AGA GAG AGA GYC GAG AGA GAG AGA GAG AYG
0.5mol?L EDTA(PH 8. 0)：在80mL水中加入18.61g Na2EDTA·2H2O，在磁力搅拌器上加热搅拌，调pH至8.0溶解（约需2.0g NaOH），定容至100 mL，高压灭菌。
2×CTAB提取缓冲液：称取2.00g CTAB和8.19 g NaCl，加入10 mL Tris-HCl（1mol?L-1， pH 8.0）和4 mL EDTA（0.5mol?L-1， pH 8.0），定容至100mL，高压灭菌。
TE缓冲液：取1.0mL Tris-HCl（1mol?L-1， pH 8.0）和0.2 mL EDTA（0.5mol?L-1， pH 8.0），定容至100mL，高压灭菌。
5 × TBE缓冲液：54.0g Tris碱，27.5g 硼酸，20 mL EDTA（0.5mol?L-1， pH 8.0），定容至1000mL。
EB（溴化乙锭）：称取0.01g溴化乙锭加入1.0mL H2O中溶解，室温避光保存。 1.0%琼脂糖凝胶：称1. 0g琼脂糖加入到100 mL 0. 5 × TBE中，在微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖完全溶解，冷却至60 ℃，加入EB至0. 5μg/mL，充分混匀。
2% CTAB的提取缓冲液（2% CTAB，100mmol?L-1 Tris-HCl，20mmol?L-1 EDTA，1.4mol?L-1 NaCl），其他浓度的CTAB的提取缓冲液仅改变CTAB的含量，其它成分不变。
TE缓冲液：取1mL Tris-HCl (1mol?L-1，pH8.0 ) 和0.2mL EDTA (0.5mol?L-1 pH8.0 )加蒸馏水至100mL，高温高压灭菌，室温保存。
四.实验步骤 1. 形态学鉴定
查阅相关资料，对麦冬样品进行区分。 2. 显微鉴定
查阅资料，显微下观察麦冬样品特征部位，并进行标注。 3. 分子标记鉴定
3.1麦冬样品DNA提取
植物细胞中含有较多的多糖、多酚等次生产物，多糖、多酚类物质对DNA的提取及其纯度有较大影响。多酚类物质易氧化，而呈褐色。通常采用在提取过程中加入β-巯基乙醇，防止多酚的氧化。多糖对所提DNA的纯度影响较大，若所提取的DNA中含有多糖，则琼脂糖凝胶电泳后，应多糖不带电荷，不能涌动，吸附少量DNA而停留在点样孔，使点样孔出现较亮条带。故在DNA提取中应尽量去除多糖和多酚。本实验采用常用的提取植物基因的方法—CATB法。基本步骤如下：
-1
① 取适量叶片粉末于EP 管中， 加入2μL 2 %β-巯基乙醇，加核分离缓冲液至1ml(样品发黄时可多加)，振摇数次，6000 r?min-1，离心1.5分钟，小心倾去上清。
② 加入700 μL经65 ℃预热的CTAB的提取缓冲液，和4μL 2 %β-巯基乙醇，颠倒混匀，于65 ℃温育30 min。每隔几分钟轻颠倒一下。
③ 取出离心管，冷至室温，加入等量氯仿-异戊醇（24∶1）轻轻颠倒混匀10 min。 ④ 12000 r?min-1离心10 min，将上清液转入另一EP管中。
⑤ 向上清液加入1 %RNA酶，37 ℃水浴30 min（室温也可）。加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）混匀，以12000 r?min-1的转速离心10 min。
⑥ 取上清加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇，-20℃放置30 min或过夜，再8000 r?min-1离心10 min，小心倾去上清液。
⑦ 分别用 70％乙醇和无水乙醇洗涤沉淀两到三次，在超净工作台上风干。
⑧ 加入100 μL TE缓冲液充分溶解，于4℃保存备用，若长期保持则-20℃保存备用。 ⑨ 取上述DNA溶解液，用1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。 3.2DNA含量测定
3.2.1琼脂糖凝胶电泳检测：
用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的基因组DNA，凝胶加EB(0.5μg·μL-1)染色。DNA样品上样量为5μL，与1μL体积的Loading Buffer溶液混合均匀上样，电泳条件为0.5×TBE, 以5-7v／cm的电压电泳。电泳结束后用凝胶成像分析系统观察，并拍照。
3.2.2紫外分光光度法检测：
用核酸蛋白仪测定模板DNA 浓度，用TE缓冲液稀释基因组DNA，并用TE缓冲液作空白，设定好参数，参数包括日期、检测波长、稀释倍数和光路长度等。完成空白的校正后，测DNA浓度，记录仪器自动生成的260 nm、280 nm处的紫外吸收值、 A260/A280比值和DNA的浓度
3.3RAPD扩增
经优化所得的PCR扩增体系为：总体积为25μL，其中含有基因组模板DNA1μL（约60ng），10×buffer2.5μL，Mg2+2.0mmol?L-1，Taq酶1.5U，dNTPs0.2mmol?L-1，引物0.5μmol?L-1 。并加入石蜡油一滴，短暂离心。
PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性45s，37℃退火45s，72℃延伸90s，40次循环，72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物于1.5 ％琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪上观察并
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