第5课时 微生物的实验室培养(二)
[学习导航] 1.通过阅读教材P16～17“(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基”，掌握配制培养基的步骤和倒平板操作的过程。2.结合教材P18～19“(二)纯化大肠杆菌”，理解并掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法来纯化微生物的方法。
[重难点击] 1.掌握制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法。2.学会用平板划线法和稀释涂布平板法纯化微生物。
一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基是细菌培养中常用的一种培养基，大肠杆菌的纯化就是用的该培养基。
1.牛肉膏蛋白胨培养基的成分及各成分提供的营养
培养基组分 牛肉膏5.0 g 蛋白胨10.0 g NaCl 5.0 g 蒸馏水定容至1 000 mL
2.制备步骤 (1)培养基的配制
计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100 mL培养基时各成分的用量 ↓
提供的主要营养物质 碳源、氮源、磷酸盐和维生素 碳源、氮源和维生素 无机盐 氢元素、氧元素 ??1 g蛋白胨：易吸潮，要迅速称取?牛肉膏也是?称量?0.5 g NaCl
??2 g琼脂
↓
0.5 g牛肉膏：比较黏稠，用称量纸称取
? ↓加热溶化后取出称量纸?
加蛋白胨和NaCl
? ↓微火加热、不断搅拌溶化?溶解后加琼脂?需不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底
? 而导致烧杯破裂? ↓??熔化后，补加蒸馏水至100 mL
↓ ↓
分装：趁热分装到洁净锥形瓶中 ↓
加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水 ↓
包扎：外包牛皮纸，且挂标签
??①培养基：高压蒸汽灭菌(2)灭菌?
?②培养皿：干热灭菌?
牛肉膏和称量纸＋水
调节pH：1 moL的NaOH、pH试纸，将pH调为7.4 ～7.6
(3)倒平板
①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 ②右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。
③用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
④等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
1.填表比较溶化时两次使用玻棒搅拌的目的
操作 往烧杯中加入蛋白胨和氯化钠后用玻棒搅拌 加入琼脂，加热使其熔化的过程中使用玻棒搅拌
2.倒平板时的注意事项
(1)培养基灭菌后，需要冷却至50 ℃左右时，才能倒平板的原因是什么？你用什么办法来估计培养基的温度？
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搅拌的目的 促使蛋白胨和氯化钠溶解 防止琼脂糊底而导致烧杯破裂 答案 琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不及时操作，琼脂会凝固。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 (2)分析下图，回答①、②问题：
①为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答案 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
②从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？
答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。 (3)怎样判断制备的培养基是否合格、成功，是否受到污染？
答案 未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
1.某学校开展大肠杆菌培养活动，首先对实验室进行清扫和消毒处理，然后准备各种原料和用具。请回答下列问题：
(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料： 。 (2)微生物在生长过程中对各种成分需求量不同，配制培养基时各成分要有合适的 。在烧杯中加入琼脂后要不停 ，防止 。
(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌。灭菌完毕后拔掉电源，待压力表的压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。 答案 (1)牛肉膏、蛋白胨、蒸馏水、NaCl、琼脂
(2)比例 搅拌 琼脂糊底引起烧杯破裂 (3)高压蒸汽灭菌锅 废弃 2.制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，关于倒平板的具体描述正确的是( )
①待培养基冷却至40 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板 ②将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞 ③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰 ④用左手的拇指和食指完全打开皿盖 ⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖 ⑥等待平板冷却5～10 s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上
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A.①③④⑤ B.④⑤⑥ C.③⑤ D.①②④⑥
问题导析 (1)培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板，原因是琼脂在44 ℃以下凝固。
(2)倒平板的过程要在酒精灯火焰附近进行。 答案 C
解析 琼脂是一种多糖，在98 ℃以上可溶解于水，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。无菌操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。等待平板冷却凝固(大约需5～10 min)后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。 一题多变
倒平板的过程需要进行无菌操作，在培养基的制备过程中，还有哪些环节需要进行无菌操作？ 答案 要对培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌，酒精灯火焰旁属于灼烧灭菌。
二、微生物的分离与纯化技术
1.纯化大肠杆菌 (1)平板划线法
①原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 ②步骤
接种环灭菌：将接种环放在酒精灯火焰上灼烧直至烧红 ↓
a.在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞
??b.将试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的取菌种?c.将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液
??d.将试管口通过火焰，并塞上棉塞↓
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