《太子参脱毒种苗繁育技术规范》(20180304)

《太子参脱毒种苗繁育技术规范》

1 任务来源

为贯彻落实《国务院关于加快培育和发展战略性新兴产业的决定》、《“十二五”国家战略性新兴产业发展规划》和“十二五”《生物产业发展规划》，推动中药产业链的标准化建设，针对中药标准化程度不高，标准体系不健全，缺乏优质质量评价技术标准等关键问题，2015年国家启动中药标准化建设项目。太子参饮片是一种临床常用的中药饮片，随着太子参野生资源的减少，人工栽培资源已成为商品药材的主要来源。国内三大太子参产区在福建柘荣、贵州施秉和安徽宣城，江苏句容和山东临沭也有少量种植。然而，由于缺乏相应的国家质量标准，广大农户仅凭传统经验分散种植，太子参种苗普遍带病毒，品种退化、叶片皱缩、块根变小、产量和品质下降；叶斑病、白绢病等真菌性病害严重，种植户大量使用农药来控制病情，存在重金属和农药残留量超标的风险；同时，由于缺乏科学合理的饮片加工、存储工艺，经常造成药材霉变，引起不必要的经济损失；此外，国内市场上的太子参药材多是“看货评级、分档议价”、“辨状论质”，目前其含量测定还没有相应国家标准，饮片质量无法得到保障。为了统一标准，规范产品和市场，国家中医药管理局和国家发展改革委员会以国家标准化项目形式，下达了《太子参标准化建设》（项目编号：ZYBZH-Y-FJ-08）的任务。 2 工作简况

2016年，成立了以福建西岸生物科技有限公司、福建中医药大学、福建省中医药研究院、宁德师范学院为起草单位的编制小组。编写组调研了国内太子参主产区太子参种苗繁育生产技术及生产现状，查阅了太子参相关的地方标准，结合课题组长期开展的太子参脱病毒种苗繁育技术的研究及应用情况，总结了太子参脱病毒种苗繁育技术在企业植物工厂化育苗车间及大田扩繁基地生产实际及广大种植户的推广应用经验，形成了《太子参脱毒种苗繁育技术规范法》国家标准的草案。

3 标准的制定原则、标准的主要内容与论据 3.1 标准制定原则

本标准在依据国内农业行业经济作物脱病毒种苗繁育生产技术基础上，参考

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技术成熟的《马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程》【GB/T 29735—2012】，结合课题组长期开展的太子参脱病毒种苗繁育技术的研发及多年的应用情况，特制定此《太子参脱毒种苗繁育技术规范》标准。

本标准对太子参脱毒种苗生产的准备、脱病毒培养方法、脱毒苗扩繁、脱毒微块根生产、脱毒种参扩繁的技术要求进行了较规范的操作规定，并绘制了太子参脱毒种苗的繁育生产流程图，以确保太子参脱毒种苗繁育生产的可操作性、实用性和高效性。

3.2标准的主要内容与论据

3.2.1 子参脱毒种苗繁育技术规范的必要性

3.2.1.1全国太子参种苗带病毒率近100%，严重影响生产

太子参主产区的福建柘荣、贵州施秉、安微宣城基本都以太子参块根进行繁殖，较少用种子繁殖。太子参块根种植，一年可收成，而种子繁殖，第一年育苗，第二年种植才可收成。福建柘荣的太子参主栽品种“柘参2号”不结种子，都以块根进行繁殖生产。

太子参栽培生产长期以块根进行无性繁殖，种参受病毒侵染积累，致使其病毒病普遍发生，种质退化严重，栽培的种苗表现出花叶病病症。2015～2017年，项目组收集栽培并检测全国太子参主产区的栽培品种，其太子参种苗带病毒率是100%（见图3），这与已有文献报道的结果一致。太子参各栽培品种田间生长表现出花叶病病症的植株占30%～100%，各花叶病株均呈现出叶脉间斑驳花叶、叶片皱缩、植株矮小的症状，受到病毒侵染的太子参块根变小、块根数变少、产量和品质下降，减产20%～70%，严重影响了太子参的种植效益和药材品质，成为太子参产业发展的瓶颈。

3.2.1.2太子参脱毒种苗繁育生产应用，增产增效显著

培养脱病毒种苗是目前生产上解决植物病毒病的最有效方法。太子参主产区所在的福建省和贵州省均已开展了多年的太子参脱病毒组培苗的研究和生产应用。2013年，贵州省发布了《施秉太子参组织培养与无毒种苗繁育技术规程》地方标准（DB52/T 847.3-2013）。福建省已开展了十年的太子参脱病毒种苗繁育技术研发应用，与贵州省发布的地方标准相比，本标准开辟了一种更为有效的太子参脱病毒方法“太子参种胚离体诱导培养脱毒苗”，且创新性建立了一套太子

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参脱毒微块根移栽扩繁的技术体系并有效应用于生产。与脱毒组培苗相比，太子参脱毒微块根具有存储方便、移栽迅速、生产管理简单、成活率高、成本低、顺应栽培季节等优特点，本标准规范了太子参脱毒微块根的生产技术，省去了太子参脱毒组培苗的移栽炼苗管理等生产环节。位于福建柘荣的福建西岸生物科技有限公司从2013年开始，就按照该本技术规范进行太子参脱毒苗的工厂化繁育生产，表现出良好的可操作性、实用性和高效性。太子参脱病毒种参与常规种参田间对照栽培比较，脱病毒种参产量提高显著（见表3，图6，图7；表5，图8，图9），栽培生产过程中，使用脱毒种参栽培的太子参，其农药使用量可大幅度降低，表现出良好的经济、社会和生态效益。 3.2.2 关于太子参脱毒种苗繁育生产技术规范 3.2.2.1 太子参组培苗繁育生产技术已成熟

植物的组培技术很成熟，已广泛应用于经济植物的脱病毒种苗繁育生产。太子参是草本植物，其组培苗诱导分化和生根壮苗培养都较容易，使用常用的MS基础培养基，配比使用细胞分裂素（6-BA）和生长素（NAA）这两种常见的激素，就可获得很好的组培繁育效果，通过对比试验，筛选出合适的太子参茎尖和种胚培养的诱导培养基:MS+1.0～2.0 mg/L 6-BA+0.1～0.2 mg/L NAA，生根壮苗培养基:MS+0.1～0.2 mg/L NAA，建立其良好的组培再生技术体系。其培养基的制备、环境灭菌、接种器具灭菌等按常规的组培操作技术进行(见图1)。

MS基础成分 生长调节剂 白糖 凝胶剂 水分

图1 太子参培养基配制流程图

混合

加热溶解 搅拌均匀 洗涤

定容 调pH值

培养容器 干燥 分装

存储 冷却 高压灭菌

3.2.2.2 规范了一种更为有效的太子参脱病毒方法

本标准增用了一种更为有效的太子参脱病毒方法“太子参种胚离体诱导培养脱毒苗”。植物病毒通常是通过维管束进行扩散传播，茎尖的顶端分生组织细胞不断进行分裂生长，未与维管束直接相连，一般未受病毒侵染，剥取微小的茎尖

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生长点进行培养可达到脱病毒的效果，这是常规的植物脱病毒方法。植物种子的胚是由受精卵发育而来，胚在胚珠中发育形成，也没有与维管束直接相连，是未受病毒侵染的，剥取太子参种子的胚进行诱导培养，形成的组培苗通常也是没有病毒的，本标准中，建立了太子参种胚离体诱导培养脱毒苗的技术操作规范。本课题组2010年在《种子》期刊发表了论文《太子参种子特性及种胚离体诱导培养技术研究》，经过这么多年的生产应用，提高完善，形成了成熟规范的太子参种胚离体诱导培养脱毒苗操作技术（见图2）。

图2 太子参种子种胚离体诱导培养过程

3.2.2.3 关于太子参诱导培养和生根壮苗培养温度不同

太子参具有低温萌芽、适温生长的自然特性，剥取的种胚或茎尖生长点在诱导培养基培养时，培养温度适当调低，控制在22±2 ℃，并避光培养，能促进培养材料的分裂增殖，获得更好的诱导培养效果，然后通过弱光环境的培养形成小苗，再转接到生根壮苗培养基中，温度控制在24±2 ℃，进行常规的光照培养，形成健壮组培苗，达到了优良的生根壮苗效果。 3.2.2.4 关于太子参脱毒苗病毒检测技术

课题组采用现代分子生物学的逆转录与聚合酶链式扩增反应相结合（RT-PCR）的技术，开展太子参脱毒苗的花叶病病毒分子检测研究。据资料，侵染太子参的病毒主要有太子参芜青花叶病毒（TuMV）和太子参蚕豆萎焉病毒2（BBWV2），这2种太子参病毒都是RNA病毒，表现出花叶病症状。RT-PCR技术是RNA分子

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在逆转录酶的作用下合成 cDNA，再以cDNA为模板，通过PCR扩增相应目的片段，是检测RNA分子的有效技术。采用RT-PCR技术检测太子参花叶病毒，具有速度快、稳定性好、灵敏度高、特异性强的特点。本课题组已《园艺学报》期刊发表了《太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重RT-PCR检测》，并申请了发明专利《用于检测太子参病毒的双重RT-PCR试剂盒及检测方法》。

太子参不同产地植株样品病毒检测结果显示：福建柘荣常规栽培的柘参1号、柘参2号、柘参3号，及引种栽培的江苏种、湖南种、贵州种、山东种的太子参中均检测出太子参花叶病病毒。其中，柘参3号检测出太子参芜菁花叶病毒（TuMV），湖南种检测出太子参蚕豆萎蔫病毒（BBWV），其他品种的太子参样品均检测出太子参芜菁花叶病毒（TuMV）和太子参蚕豆萎蔫病毒（BBWV）；采用种胚脱毒和茎尖脱毒的太子参组培苗样品均未检测出病毒（见图3）。

1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12

A

1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12

B

图3 太子参样品的RT-PCR病毒检测结果

A为TuMV，B为BBWV2；1：阴性对照；2～4：依次为福建柘荣的柘参1号、柘参2号、柘参3号太子参样品；5～8：依次为江苏种、湖南种、贵州种和山东种的太子参样品；

M：DM2000；9～11：种胚脱毒的组培苗；12：茎尖脱毒的组培苗。

3.2.2.5 关于太子参脱毒微块根的生产应用

本标准规范的太子参脱毒种苗繁育生产过程中，不是使用常规的脱病毒组培苗进行炼苗移栽生产，而是诱导太子参脱毒组培苗在培养瓶内形成微小块根（简

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