细胞因子信号传导抑制因子-3

SOCS-3在妊娠期肝内胆汁淤积症母胎界面的表达及意义

李明月 张丽娟＊

【摘要】目的 初步探讨细胞因子信号传导抑制因子-3（suppressor of cytokine signaling-3 ,SOCS-3）在妊娠期肝内胆汁淤积症母胎界面的表达及意义。方法 选择单胎产妇45例，其中ICP组30例为试验组，分为ICP重型组10例和轻型组20例，对照组为健康孕妇15例，无妊娠并发症与合并症。采用免疫组化的方法测量胎盘SOCS-3的表达，采用ELISA的方法检测胎盘组织匀浆IL-10及INF-γ的浓度。结果 1 SOCS-3主要表达于细胞滋养细胞和合体滋养细胞，偶见绒毛基质细胞阳性表达，散在分布于蜕膜间质内，蜕膜局部子宫血管壁可见阳性表达；2 ICP组胎盘组织SOCS-3的表达较正常妊娠组明显降低，ICP组重度者SOCS-3的表达较轻度低，两两比较差别均有统计学意义（P﹤0.01）;3 ICP组胎盘组织分泌IL-10较正常妊娠组明显降低（P﹤0.01）,而INF-γ较正常妊娠组明显升高，差别有统计学意义；4 ICP胎盘组织表达SOCS-3与胎盘组织分泌INF-γ/IL-10呈负相关性。结论 SOCS-3表达明显降低，可能参与了ICP的发病，SOCS-3降低导致ICP可能与Th1/Th2比例失衡有关。

【关键词】SOCS-3 妊娠期肝内胆汁淤积症 IL-10 INF-γ 胎盘

Expression and significance of socs-3 on placenta in Intrahepatic cholestasis of pregnancy

【Abstract】Objective:To explore the expression and significance of socs-3 on placenta in Intrahepatic cholestasis of pregnancy.Method:45 cases were selected in this study.Expression of socs-3 in placenta collected from 30 ICP patients including mild (n=20)and severe(n=10) and 15 normal later pregnancy women were assessed by immunohistochemistry analysis.At the same time, The density of IL-10 and INF-γ from placenta homogenate are measured by ELISA.Results:1 socs-3 immunostaining is mainly localized in the syncytio- trophoblast layer in the villous tissue.Sometimes in the matrix cell and vessel wall of decidua.2 socs-3 immunostaining was much reduced in the villous tissue from ICP placentas, both in preterm and term placentas, compared to those from normal placentas.3 IL-10 from placenta homogenate of ICP was much reduced, compared to those from normal placentas and it was

contradictory to INF-γ.Conclusion: The depressed expression of socs3 in ICP is possible one of the pathogenesies of ICP and may relate to the ratio disequilibrium of Th1/Th2.

【Key word】SOCS-3 IL-10 INF-γ ICP placenta

细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokinesignaling,SOCS)是近年来新发现的一类负向调节蛋白,可抑制多种细胞因子的信号通路,且大多数成员可被细胞因子和生长因子所诱导产生。目前已发现8种SOCS分子,即SOCS1-7及CIS(cytokine inducible SH2 containingprotein),其中SOCS1、SOCS2、SOCS3在机体免疫调控中的作用较突出。辅助性T淋巴细胞-1(T helper cell,Th1)型细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)和辅助性T淋巴细胞-2(T helper cell,Th2)型细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等均可有效诱导SOCS的产生,而它们反过来又可抑制上述细胞因子的信号转导过程[1]

有研究认为在人和小鼠免疫网络的调节是被SOCS蛋白所控制的,如SOCS3使T细胞朝有利于妊娠维持的Th2细胞的分化[14]

近来的体内实验观察到SOCS1基因敲除小鼠胸腺变小,成熟的B细胞丢失,生长发育迟缓并死于肝脂肪变性之前,这些症状与IFN-γ的高表达有关[17]。缺失SOCS1表现对IFN-γ反应的失调,导致脂肪变性和肝坏死及过多的T细胞的激活等。相比较,缺乏SOCS2的小鼠虽然是健康的和能生育的,但是表现为过度的生长。SOCS2对生长激素(GH)/胰岛素样生长因子I(IGF-I)系统起主要调节作用,在

SOCS2基因敲除小鼠一些器官上可观察到IGF mRNA的高表达,SOCS2主要是抑制GH或IGF-I的信号传导[18]。有研究表明SOCS3缺失小鼠滋养细胞受损,胎鼠围产期死亡,提示SOCS3在胎盘发育和胎鼠生长发育中起着不可替代的作用[19]。人足月分娩前绒毛、绒毛膜也见SOCS3等蛋白表达,分娩后绒毛或绒毛膜SOCS3等蛋白消失,提示SOCS3蛋白可能与妊娠的维持有关,进一步证明了SOCS3的重要作用[20]。有研究认为小鼠SOCS3基因敲除和SOCS3转基因高表达导致的胚胎死亡与肝红细胞生成素(EPO)的破坏有关[21],但也有研究认为SOCS3缺乏导致的胎儿死亡与白血病抑制因子(LIF)过度激活和过多的滋养层巨细胞分化有关[22]对SOCS3基因敲除中孕小鼠死亡胚胎的研究可以证实,其胚胎的死亡与胚胎的畸形无关,而与胎盘某些特定部位的异常有关,且胚胎没有缺陷的红细胞生成[23]。因此认为SOCS3是胎盘发育所必需的,但是对胎儿的红细胞的生成并不是必不可少。

Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12和Th2型细胞因子IL-4都能诱导不同的SOCS在Th细胞上的表达,而SOCS蛋白对Th细胞的分化具有重要调控作用,主要通过对IFN-r/STAT1、IL-4/STAT6、IL-12/STAT4三条通路的调控实现。IFN-γ/STAT1途径和IL-12/STAT4途径是Th1分化所必需的,IL-4/STAT6途径是Th2分化所必需的,这三条信号途径均受SOCS蛋白的调控[8]。未被激活的CD4+T细胞低表达SOCS1、SOCS2、SOCS3基因,伴随初始Th细胞的分化,SOCS基因的表达发生明显变化。SOCS1在Th2细胞上的高表达可抑制IL-4介导的STAT6激活,构建一个反义的SOCS1 cDNA沉默基因可诱导Th2细胞STAT6持续的激活,进而促进Th2细胞的扩增。IL-4除通过STAT6途径促进Th2分化外,尚可通过STAT1途径诱导SOCS蛋白的上调而促进Th2细胞的生长分化[9]。SOCS3主要表达在Th2细胞中并抑制Th1型免疫反应[10],相反,SOCS1主要表达在Th1细胞中并抑制Th2型免疫反应[11]。此

外,SOCS2对Th1和Th2的调节可能是通过SOCS2作为细胞因子刺激信号抑制SOCS1的作用而实现的[12]。对SOCS3的转基因小鼠的研究表明在T细胞高表达SOCS3导致偏向Th2的分化,这可能因为SOCS3抑制IL-12介导的STAT4的激活,从而阻止了Th1分化。在Th2型过敏性疾病中,SOCS3在T细胞中高水平表达。此外,SOCS3基因转染后明显减少了Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ的水平。由此可见SOCS3对于Th2细胞分化具有重要作用。

妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一种妊娠中晚期特有的并发症，对围产儿的危害极大，可造成胎儿宫内窘迫、早产甚至死胎，增加围生儿发病率和病死率，其病因及发病机制至今尚不十分清楚。随着分子生物学和分子免疫学等技术的应用，生殖免疫调节机理的研究取得很大进展，Th1/Th2细胞因子平衡与妊娠结局关系密切。正常妊娠母胎界面处于以Th2为优势的免疫平衡状态之中。如存在以Th1为主的Th1/Th2平衡失调，则可导致流产、早产、妊娠期高血压疾病等病理妊娠。众多研究发现ICP患者存在以

Th1为主的Th1/Th2平衡失调，但是Th1/Th2平衡失调的调节机理不明。近年来研究表明细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）对Th1/Th2平衡的调节有关，Th细胞分别向Th1、Th2分化时，出现SOCS-3的不同表达，在Th2为优势的疾病中SOCS-3表达增强，而以Th1为主的疾病中SOCS-3表达减弱或消失。早孕母胎界面SOCS-3较自然流产表达高，而妊娠期高血压疾病母胎界面SOCS-3较正常晚孕者降低。由于ICP存在与自然流产及妊娠期高血压疾病相似的免疫学发病机制，推测SOCS-3可能是ICP发病原因之一，且患者SOCS-3的表达降低与Th1/Th2平衡失调有关。本研究通过比较ICP患者及正常晚孕组胎盘组织表达SOCS-3及Th1型细胞因子INF-γ/Th2型细胞因子IL-10的情况，来观察SOCS-3与ICP的相关性。

材料与方法

一 研究对象和分组

选择2008年4月-2009年1月在中南大学湘雅二医院分娩的单胎产妇45例，其中ICP组患者30例，重度10例，轻度20例，平均孕龄37.1±2.56周，平均28.7±3.76周岁,正常晚孕15例为对照组，平均孕龄37.6±2.35周，平均29.1±2.14周岁, 以上各组在孕龄、孕周方面没有统计学差异。

ICP诊断标准:(1)妊娠中晚期出现皮肤痉痒，且痉痒只与妊娠有关;(2)肝功能转氨酶轻至中度升高，可达正常值的2-10倍，血清胆汁酸水平升高，可超过正常值的100倍;(3)有黄疽者总胆红素水平(TBIL)一般不小于85.5umol/L;(4)所有症状及实验室指标均在产后6周内恢复正常;(5)排除肝炎、胆囊炎、胆道堵塞等疾病。另新生儿、胎盘及脐带均无明显畸形。

ICP分型标准[1]: (1)轻型:发病孕周>34周，病程<3周，以局部痉痒为主;血清胆红素<34umol/1，血清胆汁酸<40umol/1, ALT<200U/l (2)重型:发病孕周<34周，病程>3周，全身痉痒严重，有抓痕;血清胆红素>34umol/1，血清胆汁酸>40umol/l, ALT>200U/l,(和、或)合并重度妊娠期高血压疾病。根据上述标准，本组轻型20例，重型10例。

对照组为健康孕妇15例，无妊娠并发症与合并症，入院前未经过任何治疗或摄入外源性激素。所有病例均无其它产科并发症及原发性高血压、糖尿病及肾脏病等合并症。 二 方法

2.1 标本采集与处理

胎盘娩出后在脐轮正对面用生理盐水冲洗胎盘表面三遍并纱布擦干，立即剪取组织两块，其中一块放入10%甲醛中固定,固定24-48小时后予酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋待用。另一块置电子天平称取400mg,用生理盐水按W:V =1:2.5稀释，匀浆机中匀浆，3000r/m离心10分钟，提取上清液，10000r/m离心

30分钟，提取上清夜，置-70℃的液氮里冻存，待所有标本取齐后解冻待用。 2.2 标本检测与方法

2.2.1 采用免疫组化SP法，标本经固定，包埋，制成蜡块，切片，脱蜡，水化，高压修复，标准免疫组织化学操作程序，DAB显色，采用免疫组织化学试剂盒(深圳晶美生物有限公司)，每批免疫组化均设有用PBS代替一抗的阴性对照。

2.2.2 将胎盘匀浆上清夜解冻，用ELISA法测定IL-10及INF-γ的表达，测量OD450值。

2.3 结果判断方法

2.3.1 显微镜下观察切片的染色情况。细胞内出现棕黄色颗粒为阳性表达。选取

绒毛形态清晰，染色清楚的部位视野为观察视野。采用双盲法，随机计数观察 5个视野，每个视野计数200个细胞;综合染色强度和阳性细胞所占比例进行平均半定量处理。染色强度评分标准:不着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分;阳性细胞所占比例评定标准:无阳性颗粒物质或只有极少数颗粒为-，小于25%的细胞有阳性颗粒物质判为士，25%～50%的细胞有阳性颗粒物质为+，50%～75%为++，>75%的细胞有阳性颗粒物质判为+++。两种评分的相关性，0～1分为—～±，2～3分为+，4～6分为++，6分以上为+++。观察至少10个具有代表性高倍视野，阳性细胞<5%为阴性(-)，5%～10%为弱阳性(+)，11%～50%为中度阳性(++)，>50%为强阳性(+++)，对免疫组化结果进行评估。

2.3.2 ELISA结果判断以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 2.4统计学方法

2

实验数据采用SPSS11.0统计软件进行统计。阳性率之间的比较采用χ检验，样本均数采用t检验，两变量之间的关系分析采用Spearman相关分析表示，结果均以P<0.05为差异有显著意义。

结 果

一 SOCS-3在胎盘上定位：SOCS-3主要表达于细胞滋养细胞和合体滋养细胞胞浆内，偶见绒毛基质细胞阳性表达，散在分布于蜕膜间质内，蜕膜局部子宫血管壁可见阳性表达，见附图。 二 SOCS-3表达阳性率的比较

ICP重度组胎盘组织SOCS-3的表达较ICP轻度组明显降低; ICP轻度组正常妊娠组明显降低，差别有统计学意义（P<0.01），见表1。

表 1 各组胎盘组织表达SOCS-3比较

项目 例数 - + ++ +++ 阳性率(﹪) 对照组 15 2 3 4 6 86.67 ICP轻度 20 9 7 3 1 55.00 ICP重度 10 8 1 1 0 20.00 三 胎盘组织分泌IL-10及INF-γ的比较

ICP重度组胎盘组织分泌IL-10较ICP轻度组明显降低，ICP轻度组正常妊娠组明显降低，两两比较差别有统计学意义（P<0.05），而ICP重度组胎盘组织分泌INF-γ较ICP轻度组高，ICP轻度组较正常妊娠组明显升高，两两比较差别有统计学意义（P<0.05），ICP重度组INF-γ/ IL-10较轻度组高，ICP轻度组较正常妊娠组高，差别有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 各组胎盘组织分泌INF-γ及IL-10水平及两者比例比较（n=45,x±s）

项目 INF-γ(ug/l) IL-10(ug/l) INF-γ/ IL-10

对照组 10. 66 ±2. 34 1. 42 ±0. 30 8. 59 ±2. 82 ICP轻度 13. 43 ±2. 87 1. 31 ±0. 47 11. 96 ±3. 43 ICP重度 17. 82 ±3. 43 1.17 ±0. 26 16. 00 ±4. 66 四 胎盘SOCS-3表达阳性率与胎盘匀浆INF-γ/IL-10的相关性比较

ICP胎盘组织表达SOCS-3表达阳性率与胎盘匀浆INF-γ/IL-10成反比，其中ICP重度组r值为-0.89，ICP轻度组r值为-0.67，而正常晚孕组呈正比，r值为0.14，见表3