微生物检验概述
临床微生物检验即诊断微生物学，是在医学微生物学的范畴内，侧重研究感染性疾病快速、准确地检出病原体的策略与方法，为临床诊断提供依据，并指导进一步合理用药和防止感染继续扩散的学科。 临床细菌实验室的主要工作是从临床标本中分离出病原菌并进行准确鉴定，同时指导临床合理应用药物，为临床诊断、治疗、预后和流行病学调查以及医院内感染的监控提供可靠的依据。
一、临床微生物检验的目的和要求 （一）临床微生物检验的目的
1.为临床感染性疾病的诊断提供病原学依据。 2.为临床感染性疾病的治疗提供参考用药的信息。 3.为医院感染提供病原微生物及其耐药性动态信息。 4.改进或更新临床微生物检验的方法。 （二）临床微生物学检验的要求 1.快速、准确地提出检验报告。
2.检验人员必须有较丰富的微生物学基础知识和熟练、正确的操作技能，必须养成有菌观点和无菌操作的习惯。
3.临床微生物检验必须进行全面质量控制，并参加和接受质量控制考核。 4.重视实验室消毒灭菌工作。 （三）诊断试验的选择原则 1.选择有鉴定价值的试验
要对两种细菌进行鉴定，须选择一项两种菌呈现截然不同结果的试验，即一种菌呈现阳性（阳性反应的菌株阳性率须大于90%），另一种菌为阴性（阴性反应的菌株阳性率应小于10%），这项试验才有鉴定价值。否则，就没有鉴定价值。 2.选择简易、快速、方便的试验
（1）鉴定一种细菌可能有多种特异的方法，只选择其中一或两种达到目的即可，多选无意义。如金黄色葡萄球菌只选较简单的凝固酶试验就足够了。 （2）选择操作简便、快速的方法。
（3）选用复合培养基，一次操作可同时看几个生化反应，如克氏双糖铁（KIA），动力靛基质脲酶（MIU）等。
3.综合考虑试验的敏感性和特异性
敏感性=所有阳性结果数／所有感染病人数，试验敏感性越高，假阴性结果就越少。特异性=阴性结果总数／未感染病人数，特异性越高，假阳性结果越少。试验的敏感性和特异性是相互联系的，试验的敏感性增加，会使特异性下降，反之亦然。
二、标本的采集和运送
对感染性疾病进行病原检查和鉴定，须通过采集患者的标本，经系列实验，才能获得明确的病原学诊断。标本质量直接影响诊断结果，不当的标本可导致假阴性、假阳性结果的出现，因此，在标本采集、送检、保存等各个环节都要规范操作，严格控制，是确保实验结果准确可靠的前提。
（一）标本采集的一般原则 1.早期采集
最好是病程早期、急性期或症状典型时，而且必须在使用抗生素或其他抗菌药物之前采集。 2.无菌采集 采集的标本应无外源性污染。在采集血液、脑脊液、胸腔积液、关节液等无菌标本时，应严格进行无菌操作；对于与外界相通的腔道，如窦道标本应由窦道底部取标本，采集的标本均应盛于无菌容器内。 3.根据目的菌的特性 厌氧菌、需氧或兼性厌氧菌，以及L型菌采用的方法不同。 4.采集适量标本
采集量不应过少，而且要有代表性，同时有些标本还要注意在不同时间采集不同部位标本。 5.安全采集
采集标本时不仅要防止皮肤和黏膜正常菌群对标本的污染，同时也要注意安全，防止传播和自身感染。 （二）标本的处理
一些对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立即送检，而其他所有的标本采集后最好在2h之内送到实验室。若不能及时送检，标本应置于一定环境中保存。一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h。 厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送。 病人标本中可能含有大量致病菌，不管标本运送距离远近，都必须注意安全防护。标本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必须包装好，防止送检过程中倒翻或碰破流出。对于烈性传染病标本运送时更要特别严格，必须按规定包装，由专人运送。
三、微生物检验
临床微生物学实验室接到标本后应立即进行微生物检验。主要包括直接镜检、检测特异性抗原或病原体成分、进行分离培养和鉴定、体外药敏试验等，各种检查方法的比较见表5-9-1。
表5-9-1微生物检查方法、判断和速度 方法 直接镜检 免疫荧光（直接法） 乳胶凝集 对流免疫电泳 气-液相色谱 PCR DNA探针 微量鉴定系统 常规法
（一）直接镜检
标本经涂片、染色、镜检，有些标本如尿液、脑脊液等经过离心浓缩后镜检，其初步结果对疾病诊断有参考价值。直接镜检对于确定进一步检出步骤及鉴定方法也很有帮助。另外，直接镜检还可评价标本是否符合检验要求。 （二）快速诊断
快速检测病原体成分主要是指特异性抗原和核酸检测。特异性抗原检测包括免疫荧光技术、胶乳凝集试验、酶免疫技术、对流免疫电泳、化学发光测定等。核酸检测包括核酸杂交、PCR技术。其他快速检测法
鉴定类型 初步诊断 快速诊断 快速诊断 快速诊断 鉴定 快速诊断 诊断、鉴定 鉴定 确定诊断 速度 5～10min 1～2h 15～30min 2h 1.5～2h 数小时 1～3天 3～6h 数天或以上 还有气一液相色谱法、化学发光、生物发光测定法和基因或蛋白芯片技术等。 （三）直接药敏试验
直接药敏试验即在分离培养病原体的同时，直接将临床标本接种于平板，用抗生素纸片作药物敏感性试验，在18～24h内可获得结果。但因其在试验时接种量难以标准化，且对混有杂菌和混合感染的标本不易明确其结果，故分离出纯培养物后应再作体外药物敏感试验。 （四）常规检验 1.分离培养
通常由正常无菌部位采取的标本接种血平板，置于空气或含5%～10%CO2的气缸中培养，大部分细菌可于24～48h生长良好。若原始培养为阴性，但据镜检结果和临床信息提示可能有病原菌存在，则应再采集大量标本，离心浓缩或溶解离心法处理，取沉淀接种营养丰富的需氧或厌氧培养基来培养。
对于存在正常菌群部位采集的标本，分离时应采用选择培养基以利于病原菌生长，也可加某些抗生素抑制污染菌的生长。对于某些感染标本中发现的细菌，如尿路感染的尿液中检出大肠埃希菌，可能是病原菌，也可能是污染菌或正常菌群，其临床意义的确定有赖于定量培养法。分别取0.1ml涂布于血琼脂平板或倾注培养，35℃24h后计算每毫升或每克标本所含细菌数。 2.鉴定
分离出的细菌一般应经过细菌形态、菌落特点、生化反应、血清学试验、动物接种等鉴定。目前尚有某些微量鉴定系统，其鉴定快速、简便，值得推广。 3.体外药物敏感性试验
常用方法包括抑菌试验、杀菌试验、联合药敏试验和检测细菌产生的抗生素灭活酶等。 （五）报告
直接镜检要求2h内报告，说明标本是否合格，发现微生物的情况和特点；初步鉴定和直接药敏结果于24h或次晨报告，报告可能的病原菌和直接药敏结果；最后鉴定和细菌药敏结果一般不超过3d，还规定除血培养外，所有送检标本必须在24h内预报。
四、血清学诊断
用已知抗原检测病人血清中抗体。人体感染病原体后经过一定时间产生特异性抗体，这种抗体在体内一般可持续数月或更长，故检测抗体可用于病原体诊断，在作血清学诊断时，一般要在病程早期和晚期分别采血清标本双份检查，抗体效价呈4倍或以上增长才有价值。除非检测IgM，单份血清一般诊断意义不大。
五、临床微生物实验室安全措施和质量保证 （一）实验室感染来源
1.在检验操作过程中的各个环节都可能产生危险的微生物气溶胶。
2.接触感染材料或使之附着于衣服带出室外以及其他偶然事故如菌液滴落于物体表面，注射时不慎刺破皮肤等。
针对以上感染源，若不进行正当防护或及时处理均易引起实验室感染。故临床微生物工作者应注意个人防护，检验时必须穿工作服、戴口罩、帽子，根据需要戴防护眼镜和橡胶手套，离去时更衣、洗手。实验室台面在工作完毕或被感染材料污染时应立即用消毒液处理。 （二）感染性废弃物的处理
1.任何污染材料未经消毒不能拿出实验室。
2.液体废弃物必须收集在防漏、未破的容器内，经高浓度的化学消毒剂处理。 3.对剩余标本、接种过的培养基、菌种等丢弃前均需适当消毒。
4.动物房的废物在处理前及动物笼被清洗前均需消毒，最好经高压蒸气灭菌。 5.对于任何有污染的锐器如针头、注射器、玻片等在处理前不要用手接触。
（三）微生物实验室的室内质控 微生物实验室的室内质控包括： 1.对细菌检验人员的要求； 2.操作手册；
3.仪器设备的功能监测； 4.培养基的质量控制；
5.试剂、染色液以及抗生素的质量控制； 6.标本检验的质量控制；
7.标准菌株的来源和保存及室内质量的全面控制。
六、动物试验
（一）动物试验种类、原理
动物实验主要用于分离和鉴定病原微生物，检测细菌毒性产物，观察病原微生物的致病性。常用实验动物有大鼠、小鼠、豚鼠、家兔及绵羊等。 （二）试验动物选择原则和动物接种法 1.试验动物选择
原则选择合适的试验动物是十分必要的，主要包括对待试微生物感染敏感性、动物的遗传种系特征及动物体内和体表微生物群鉴定，以及动物年龄、体重、性别和数量等。进行动物试验时应根据实际情况选择敏感动物和选用等级动物。 2.动物接种法
主要有皮内接种法、皮下接种法、肌肉接种法、静脉接种法、腹腔接种法和脑内接种法。接种后应每日观察1～2次，并按试验要求作详细试验记录。 （三）动物试验的应用 1.分离和鉴定病原菌
有些微生物必须通过动物试验进行分离，如立克次体及某些病毒等，结核分枝杆菌的致病性也只有动物试验才能最终确定。 2.细菌毒素检测
用动物试验检测细菌毒素是了解病原微生物毒力和致病力的一个重要方面，常用方法有白喉棒状杆菌毒力试验、破伤风梭菌毒力保护试验、大肠埃希菌肠毒素检测。
七、免疫检测技术
微生物学中常用的免疫检测技术包括凝集反应、沉淀反应、补体结合试验、免疫荧光技术、酶免疫测定及皮肤反应等。
八、发光分析技术
是依赖酶或化学反应释放能量引起发光的检测方法。具有操作简便、快速、敏感度高、无污染特点。
九、鲎试验
鲎变形细胞溶解物试验简称鲎试验。其基本原理是内毒素可激活鲎试剂中凝固酶原转变为凝固酶，使凝固蛋白原生成凝固蛋白，产生凝胶。凝胶的形成速度及其坚固程度与内毒素浓度有关。鲎试验阳性表明有革兰染色阴性菌或内毒素血症，也可用于生物制品或注射液的内毒素污染检测。
十、分子生物学在病原微生物中的应用 （一）分子生物学概念
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