IGF-1对大鼠缺血、缺氧神经元p-JNK及 p-P38表达的影响

IGF-1对大鼠缺血?缺氧神经元p-JNK及p-P38表达的影

响

李智勇,夏 鹰,陈晓东,罗 汉

【摘 要】摘 要:目的 研究胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对缺血?缺氧大鼠脑皮质神经元凋亡的保护作用及作用机制?方法 原代培养新生大鼠脑皮质神经元,建立缺血?缺氧细胞模型,观察IGF-1及IGF-1受体抑制剂(AG1024)对该模型细胞存活率(MTT试验)?细胞凋亡(流式细胞法)?JNK?P38表达(Western blot法)和Caspase-3活性(荧光测定法)的影响?结果 IGF-1(HII组)及AG1024(HIIA组)干预细胞模型24h后,模型细胞存活率分别为(77.00±3.80)%?(62.00±4.40)%;凋亡率分别达到14.58%?24.97%?IGF-1组可明显抑制p-JNK及p-P38的表达及Caspase-3的活性?结论 IGF-1对缺血?缺氧神经元损伤有一定的保护作用,并通过调控p-JNK?p-P38及Caspase-3的表达抑制缺血?缺氧神经元的凋亡? 【期刊名称】重庆医学 【年(卷),期】2012(041)016 【总页数】4

【关键词】关键词:胰岛素样生长因子Ⅰ;缺氧缺血,脑神经元;JNK丝裂原活化蛋白激酶类;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

缺 氧?缺 血 性 脑 损 伤 (hypoxia-ischemic brain damage,HIBD)是围生期新生儿脑损伤的最常见病因,重者可致永久性脑损伤,引起脑性瘫痪?智力低下等严重后遗症?其发病机制至今不明,尚无特效治疗,近年研究表明,与HIBD有关的神经元凋亡促进了继发性脑损伤[1-2]?因此,发病早期抗神经细胞凋亡成为HIBD救治的关键?胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)是一种在

体内?外均具有广泛生物学活性的细胞因子?近年来,IGF-1对中枢神经系统损伤的保护作用研究取得了一定的进展,但IGF-1作为缺血?缺氧脑损伤保护剂的作用机制研究尚不充分[3-4]?本实验以体外原代培养的新生大鼠脑皮层神经元建立类缺血?缺氧细胞模型,研究IGF-I对神经元缺血?缺氧损伤的保护作用,进一步探讨IGF-1在HIBD病理生理过程中的调控机制?

1 材料与方法

1.1 材料 重组人胰岛素样生长因子-1(recombinant human insulin-like growth factor-1,rhIGF-1)购自Sigma公司,胰岛素样生长因子受体抑制剂(AG1024)购自Calbiochem公司,Neurobasal培养基及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Invitrogen公司,微管相关蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)?c-Jun 氨 基 端 激 酶 (c-Jun-NH2-terminal kinase,JNK)?p-JNK?P38?p-P38 抗 体 购 自 Abcam 公 司,ApoAlert Caspase Fluorescent Assay Kit购自BD Biosciences Clontech公司? 1.2 方法

1.2.1 神经元缺血?缺氧模型的建立 在无菌条件下,取新生1dSD大鼠的大脑皮质,用Neurobasal培养基清洗,剪碎并通过40目不锈钢筛网过筛;将组织块置于0.25%胰蛋白酶中,振摇,37℃孵育消化10min后加FBS终止消化,过筛,滤液悬浮到Neurobasal培养基中,37℃?1 200r/min离心5min,去上清,清洗2次;沉淀加入含10?S的Neurobasal培养基中,轻轻吹打成单细胞悬液?将细胞悬液接种到用10μg/mL多聚-L-赖氨酸包被的细胞培养瓶中,置5%CO2培养箱中孵育,隔日半量换液一次;培养4d后,换不含10?S的Neurobasal培养基,将培养瓶置于低氧培养箱中,氧浓度调为1%,模拟缺血?缺氧条件培养24h?

1.2.2 实验分组 将同批培养的大鼠皮质神经元随机分为4组:(1)对照组(CON):正常培养皮质神经元;(2)缺氧?缺血组(HI);(3)rhIGF-1干预组(HII):于低氧培养箱内培养,无血清培养基中添加终浓度为100nmol/L的rhIGF-1,培养24h;(4)rhIGF-1与AG1024干预组(HIIA):于低氧培养箱内培养,无血清培养基中添加终浓度为100nmol/L 的rhIGF-1及10μmol/L的AG1024,培养24h?

1.2.3 免疫组织化学观察rhIGF-1对模型细胞的影响 各组细胞干预后,弃培养液,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤3次,4%多聚甲醛固定后进行 MAP-2免疫荧光染色?

1.2.4 rhIGF-1对模型细胞活性的影响 细胞以5×105/mL转入96孔板,进入对数生长期后更换培养液,按实验分组加入干预因素,孵育24h后,加入10μL甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(5mg/mL PBS贮存液),孵育4h,吸弃培养液,加入200μL二甲基亚砜,待颗粒溶解后放在酶标仪上,在490nm波长处检测各孔的吸光度?

1.2.5 流式细胞仪分析 采用预冷PBS冲洗留取细胞2次,重悬细胞使细胞密度为1×106/L,取100μL细胞悬液,加入5μL异硫氰酸荧光素标记的AnnexinⅤ和10μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)混匀,室温下避光孵育15min,每管内加入400μL结合缓冲液(1×),于1h内进行流式细胞分析?激发波长为488nm,计数104个细胞?所有数据均经Cell Qust软件收集处理?

1.2.6 蛋白质印迹法(Western blotting)检测 取各组细胞,弃培养液,用预冷的PBS清洗3次,100mm平皿加200μL或300μL细胞裂解液,冰面上裂解20min,15 000r/min,4℃离心10min,取上清液,Bradford法进行蛋白定量(Bio Radproteinassay)?以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,半干电