细生实验复习要点

细生实验复习要点

First：3个细胞生物学实验

实验一：光学显微镜的使用方法 使用显微镜时的注意事项

1.拿显微镜时应右手紧握镜臂，左手托住镜座，不能用一手随便斜提，以防目镜从镜筒滑出和反光镜脱落。

2.显微镜用完后，必须将目镜、物镜、反光镜等用清洁的擦镜纸或绸布轻轻擦拭，切勿口吹、手摸或用粗布擦拭，勿用乙醇及其他药物擦拭，以免侵蚀镜台或镜头。 3.使用显微镜应先用低倍镜调节光源，如观察组织细胞或染色较浅标本时，要适当关小光圈，使物像清晰。

4.放置标本玻片时，应将有盖玻片的一面朝上，用标本夹轻轻夹住玻片的两端，要把要观察的部分对准通光孔的正中央。如果玻片标本放反了，不仅不易找到物象，并且容易压碎玻片，损伤物镜。

5.观察时要两眼齐睁，用左眼从目镜中寻找物像，仔细观察，用右眼看纸绘图。使用低倍镜用粗调节器调节物距，使用高倍镜必须用细调节器调节物距。粗细调节器都不能做单方向的旋转，如一直上升粗调节器会使镜筒脱落。反之，如一直下降会压碎玻片。

6.不要随意取出物镜，以防灰尘落入。禁止任意拆卸任何零件，以防意外损失。

7.显微镜用完后，应转动粗调节器使镜筒徐徐上升，取下玻片，并转动旋转盘，使物镜离开聚光镜，下降镜筒使物镜接近镜台，再装入箱内。 实验二：动物染色体的制备 重点掌握：秋水仙素的作用

抑制纺锤体的形成，从而使有丝分裂停于中期，增加中期分裂相的比例。

选用小鼠骨髓细胞的原因：骨髓细胞数量多，分裂旺盛，不需体外培养和无菌操作，便于取材。

固定液：3:1甲醇-冰醋酸 有固定作用，对染色体还有一定的分散作用。 Giemsa染液 将细胞核染成紫红色 实验三：蟾蜍血细胞的体外融合

重点掌握：PEG（聚乙二醇）的作用过程：PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体，具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用。PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。

融合的频率和活力与所用PEG的相对分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。

试验中终止PEG作用的方法：缓慢向离心管中加入5ml Hanks溶液，轻轻吹打混匀，于37度水浴中静置5min.

异种细胞融合的意义：克服远缘杂交不亲和的障碍，在杂交育种方面有重要意义。 所用染液：詹姆斯绿染液 Second：2个分子生物学实验

实验一：鼠肝基因组DNA的提取与纯化

实验原理：DNA是染色体的主要组成成分，是遗传的物质基础。DNA在生物组织中往往以核蛋白的形式主要存在于细胞核中，分子量甚大。提取DNA最基本的要求是保持DNA大分子的完整性以及纯度，避免机械张力（剪切）引起DNA分子的降解，注意对杂质及蛋白质的去除，防止细胞内存在的DNA酶对DNA的酶解。本实验用蛋白酶K及SDS在EDTA存在的条件下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚并使细胞内存在的DNA酶失活，然后用苯酚-氯仿有机溶剂多次抽提后，用透析或乙醇沉淀得到纯化的DNA。

试剂作用：

Tris-Cl(pH 7.8):维持pH恒定，防止DNA变性和水解 EDTA（乙二胺四乙酸）：络合二价金属离子，当Mg2+被络合后细胞内释放出的DNA酶的作用被抑制，避免DNA的降解；同时金属离子络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解。

SDS（十二烷基磺酸钠）：使蛋白质变性，破坏膜蛋白的构象，使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且也具有抑制DNA酶的作用。 苯酚-氯仿混合液（分层，吸取苯酚）：使蛋白质变性 思考题：

1 从生物细胞中提取DNA的主要注意点是什么？应如何控制？

注意点：尽量保持DNA大分子的完整性及纯度，防止各种物理、化学、生物的影响。 控制：⑴动作要轻柔，使用钝口滴管，以防止外界机械性损伤 ⑵控制适宜的温度和pH，以防止DNA双链氢键断裂，变性 ⑶使用RNase(RNA水解酶）、低温、EDTA，防止DNA降解 ⑷样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子 ⑸降低其他生物大分子的污染至最低

⑹排除其他核酸分子的干扰

2 能引起DNA分子变性的因素有哪些?DNA降解和DNA变性有何区别？如何鉴别？ 因素：加热、极端的pH、有机试剂如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等

区别：DNA变性是氢键的断裂，是可逆的，对理化性质的影响如增色效应、粘度降低等；DNA降解是破坏磷酸二酯键，不可逆，会使分子量降低。

鉴别：电泳 DNA样品经琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后，在紫外光激发下，DNA分子会产生橘黄色荧光，根据条带所在位置，可判断DNA分子的大小 实验二：PCR技术检测β-actin基因 原理要掌握（见实验报告P28） 反应中各体系的作用：

Tris-HCl :提供稳定的pH=8.3的环境 模板DNA：为复制提供精确的模板 dNTP：提供原料

Tap-DNA聚合酶：提供动力 KCl ：有利于复性，使引物连接上去 Mg2+：DNA聚合酶的辅酶 BSA（牛血清白蛋白）：稳定剂 溴酚蓝：示踪剂

思考题：污染时PCR反应中最常见的问题，可采用哪些措施，防止污染？ 1 隔离不同的操作区 2 分装试剂

3 改进实验操作（手套、防止溶液飞溅 Tip、ep一次性使用 配置标准溶液混合液） 4 专用加样器 5设立阴阳性对照

也可参考实验教材P61

Third:其他四个实验

实验一：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 原理要掌握（实验报告P1)

影响电泳的因素（见课本P7）要好好看呀

思考题：1 用什么方法可以证明醋酸纤维薄膜有无电渗作用？

在充分浸泡巴比妥溶液的醋酸纤维薄膜上点样有颜色且不带电荷的染色剂；再通电进行电泳，若染色剂也随之运动，说明存在电渗作用。若染色剂不随之运动，则不存在电渗作用 2 电场强度越高血清蛋白在醋酸纤维薄膜上泳动率越高，是否电场强度愈高愈好？ 不是，电场强度越高，则带电粒子的移动越快，但电压越高，电流也随之增高，产生的热量也增加，在电场强度>50V/cm时，常需加用冷却装置，否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离，还可因发热引起缓冲液中水分蒸发过多，使薄膜上的离子强度增加，甚至引起虹吸现象（电泳缸内液体被吸到薄膜上）等，都会影响物质的分离。 实验二：①蛋白质定量测定方法-----标准曲线法测定蛋白质含量 原理掌握（实验报告P24)

②葡萄糖定量方法-----标准管法测定葡萄糖含量

原理掌握（实验报告P61）

思考题：颜色的深浅在一定范围内与血糖浓度成正比，这里的一定范围指什么？ 吸光度与浓度成正比的范围，即吸光度在0.2---0.7之间 实验三：①凝胶柱层析分离鉴定蛋白质

原理掌握（见实验报告P9)

思考题：通过讨论：哪些因素会影响凝胶层析的分离效果？

1 流速：若流速过慢，导致峰过宽，若流速过快，导致峰重叠，均达不到分离的目的 2 层析柱的选择与加样体积 3 样品浓度

4 离子强度

5 流动相（洗脱液）的选择 ②DNS---氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 原理掌握（实验报告P11）

实验四：AKP(肝碱性磷酸酶）Km测定 原理（实验报告P83）

思考题：测定AKP时，对酶反应的哪些条件要加以控制？本试验所取条件是什么？ 1 反应时间 2底物浓度 3酶浓度 4 pH 5 温度 6 不能有抑制剂、激活剂 本实验：标准酶液、pH=10、温度37度、反应时间15min、底物浓度足够