分子生物学实验指导-1

分子生物学实验指导

冲液；150V，15分钟）检测完整性。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

2．纯度 OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值（10mM Tris, pH7.5）在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

3．浓度 取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）=OD260×n (稀释倍数)×40 【注意事项】

1．RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必须在无RNase 环境中，戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、材料、容器。

2．所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处理过夜，然后高压处理或加热至70℃ 1 小时或60℃过夜，以除去石油残留的DEPC。

3．所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶活性。

4．操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套、，实验过程中手套要勤换。

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实验六、植物组织中总DNA提取与纯度鉴定

【目的和要求】

1．学习植物总DNA提取的方法和基本原理。 2．掌握DNA纯度的鉴定技术。 【实验原理】

植物组织中的DNA绝大部分是核DNA，它们通常与组蛋白及非组蛋白结合在一起，以核蛋白体（即染色质或染色体）的形式存在细胞核内。因此在核酸提取过程中需要用表面活性剂（如SDS）溶解核蛋白体上的蛋白质，使核蛋白体解聚后释放出核酸。此外，表面活性剂还具有溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂，以及抑制DNase的作用。提取液中的蛋白质可用蛋白质变性剂（如氯仿、酚等）变性沉淀，RNA可通过RNase处理除去。然后利用DNA分子易溶于而不溶于有机溶剂的性质，用乙醇或异丙醇沉淀即可分离得到所需的DNA分子。

在植物DNA的抽提过程中必须是始终注意以下几个关键问题：

（1）DNA的双螺旋结构易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、尿素、酰氨类化合物等）的影响而发生解链变性，因此，抽提时要避免采用可引起DNA变性的各种实验条件。

（2）由于DNase能把大分子的DNA酶解成碎片，所以，提取过程中必须抑制内源和外DNase的活力。目前抑制DNase活力的途径有：①低温操作；②调节pH值至8.0使溶液偏碱性；③抽提液中加表面活性剂；④加螯合剂（如EDTA），以除去酶的辅助因子（如Mg2）。

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（3）防止化学和物理因素导致的DNA降解。如过酸或过碱常可导致DNA降解。因DNA分子很大，其分子量可达1012道尔顿，所以，温度太高或机械张力的剪切常可造成DNA分子发生断裂。因此，操作过程中应尽量温和，减少搅拌次数，不要剧烈摇动。

（4）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类化合物和色素类化合物）对核酸的提取有干扰作用。所以，应尽可能选取幼嫩和代谢旺盛的新生植物组织作为抽提DNA的材料，因为幼嫩和代谢旺盛的新生组织中次生代谢物少，DNA含量高，且易于破碎匀浆。此外，用新鲜的植物材料提取DNA比用干燥植物材料要好。

本实验以新鲜水稻幼苗为材料，采用一种简便快速的方法提取制备植物DNA，然后

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用紫外分光光度法对植物DNA的纯度进行鉴定。由于核酸中的碱基具有共轭双键，所以核酸具有紫外吸收性质，其吸收高峰在260nm处，酚或色素等其它小分子的吸收峰在230nm处，而蛋白质的紫外吸收高峰在280nm处。因此，测定核酸在230nm、260nm和280nm处的消光值可作为鉴定核酸纯度的依据。经验数据表明，核酸纯溶液的A260／A230消光值之比一般大于或等于2.0，而A260／A280消光值之比一般大于或等于1.80。A260／A280比值过小，表明样品中蛋白质未脱净；A260／A230比值过小，表明样品中残存有核苷酸、氨基酸、酚或色素等小分子杂质。

紫外分光光度法不能区分DNA和RNA，但可用于测定已纯化核酸的含量。在实际应用中可根据核酸在260nm处的光吸收值计算待测核酸的浓度。当用蒸馏水作稀释液和空白对照时，OD值为1.0相当于50μg / mL双链DNA或40 μg／mL单链DNA (或RNA)，再乘上稀释倍数，即可知样品中核酸的浓度。 【教学内容】

1．植物总DNA提取原理和方法简介。 2．植物总DNA提取和纯化。 3．DNA的纯度和含量的测定。 【实验器材和试剂】

1．仪器：高速离心机、离心管、恒温水箱、研钵、冰浴、液氮罐、移液枪、紫外分光光度计。

2．试剂：

(1) DNA提取液：称取氯化钠26.298g，柠檬酸钠13.23g，EDTA 37.224g，加蒸馏水溶解，溶解时加5.5g氢氧化钠，然后再加入10g预先在小烧杯中加热溶解的SDS溶液，调pH至8.0，并定容至1000mL。

(2) 氯仿:异戊醇(24:1)混合液

(3) 5mol／L高氯酸钠：称取140.47g溶于蒸馏水，并定容至200mL。 (4) pH8.0 TE溶液：10mmol／L Tris－HCI(pH8.0)+1 mmol／L EDTA(pH8.0)。 (5) 95％乙醇

(6) 3 mol／L醋酸钠 3．实验材料：新鲜水稻幼苗 【实验方法】

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1．植物DNA的提取

(1) 称取5克水稻幼苗，在液氮中将幼苗研磨成粉末状(越细越好)。加2~6mL DNA提取液，快速研磨5分钟。

(2) 转移至离心管中，加入6mL氯仿：异戊醇(24：1)混合液，充分摇匀。于4000 rpm离心5分钟。

(3) 吸取上清液，转移至一干净20mL试管中。于72℃水浴保温5分钟，再放于冰浴中冷却。

(4) 加入上清液体积1／4的5 mol／L高氯酸钠溶液，再加入等体积氯仿／异戊醇(24:1)混合液，剧烈摇动30秒。转入离心管中，于4000 rpm离心5分钟。

(5) 取上清液，加入其体积二倍的冰冷95％乙醇，待出现丝状物后，用玻棒搅起，此丝状物即为DNA分子。 2．DNA的纯化

(1) 将提取的DNA用l mL TE溶液溶解于一离心管中。加入等体积苯酚:氧仿:异戊醇(25:24:1)混合液，轻轻摇匀。于3000 rpm离心10分钟。

(2) 吸取上清液，加等体积氯仿:异戍醇(24:1)混合液，轻轻摇匀。于3000 rpm离心10分钟。

(3) 吸取上清液，加1／10体积3mol／L醋酸钠溶液和预先置冰箱中冷却的95％ 乙醇溶液，轻轻摇匀。于3000 rpm离心30分钟。

(4) 除去上清液，沉淀用无水乙醇洗涤沉淀一次，室温静置干燥或真空抽干后， 用l ml TE溶液溶解。 3．DNA纯度及含量测定

取待测核酸溶液20μL放入1cm光程的石英比色杯中，加蒸馏水380μL(稀释20倍)。以蒸馏水作空白对照，于紫外分光光度计上测定260nm、280nm和230nm波长下的光吸收值。然后，计算出A260／A 230和A260／A280的比值，评价DNA纯度并换算比核酸的含量。 【注意事项】

1．核 DNA 分子呈极不对称的线性结构，一条染色体为一个 DNA 分子。其长度与直径的比例极不对称，使其对机械力十分敏感，分离纯化过程中 DNA 分子的断裂是很难避免的，尽可能保持 DNA 分子的完整性是 DNA 分离技术的关键。因此操作过程中动作应尽量轻柔， 转移用的枪头最好是剪过的， 避免剧烈振动可获得较长的 DNA

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