Cre重组酶的研究进展 - 图文

第４０卷第１２期２００９年１２月东北农业大学学报Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ４０（１２）：１２５－１２９Ｄｅｃ．２００９ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｒｅ重组酶的研究进展吕涛１，乔琰２，王勇ｐ１１００００）（１．东北农业大学园艺学院，哈尔滨１５００３０：２．沈阳市植物园景观部，沈阳摘要：Ｃｒｅ重组酶来源于噬菌体Ｐ１基因组中的一段ＤＮＡ序列编码的蛋白，是一种无需辅助因子即可进行位点特异性重组的生物酶。它的发现为基因靶位操作创造了有利条件，由于其作用方式高效简单，Ｃｒｅ定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，文章就Ｃｒｅ重组酶的结构、功能、突变分析和改造及Ｃｒｅ重组酶的应用潜力等方面的研究进行了综述。关键词：Ｃｒｅ重组酶；定位重组；进展中图分类号：Ｑ５５文献标识码：Ａ文章编号：１００５—９３６９（２００９）１２—０１２５—０５ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ／ＬｖＴａ０１，ＱＩＡＯＹａｎ２，ＷＡＮＧＹｏｎ９１（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｈｅｎｙａｎｇＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｒｄｅｎＬａｎｄｓｃａｐｅＤｉｖｉｓｉｏｎ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００００，Ｃｈｉｎａ），Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ，ａＤＮＡ－ｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＰ１ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｉｓａｋｉｎｄｏｆｅｎｚｙｍｅｏｆｓｉｔｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｏｕｔｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ．Ｉｔｓｆｏｕｎｄｈａｓｃｒｅａｔｅｄｆａｖｏｒａｂｌｅｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｃｒｅｓｉｔｅ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｏｐｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｔａｒｇｅｔ．Ｂｅｃａｕｓｅｏｆｉｔｓｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｇｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅａｓａｓｉｔｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｔｒａｐｐｉｎｇａｎｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。ｉｔｈａｓｂｅｅｎｕｓｅｄｕｓｅｆｕｌｔｏｏｌｆｏｒｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎｔｈｅａｒｔｉｃｌｅ，ｉｔｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｍｕｔａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ；ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；ｐｒｏｇｒｅｓｓＤＮＡ重组酶是在１９世纪９０年代被发现的，很导的遗传重组可进行定点、定时、定组织的特异性控制。该系统于１９８１年被首次发现，１９９３年被Ｃｕ等研究人员正式作为一种基因操作手段应用以来同，已广泛地应用于基因克隆、基因捕获、基因整合、多噬菌体和酵母都可以编码这种酶旧，例如来源于噬菌体的重组酶Ｃｒｅ、来自于酵母的ＦＬＰ等１３１，它们都可以在ＤＮＡ特定的位点产生作用，造成ＤＮＡ序列的插入、删除或反向。这种简单却完美的反应可以实现精确的基因重组，而且这种反应在真核生物中同样有效１４１。近年来运用Ｃｒｅ莺组酶系统已经成为目前遗传重组技术中的有利手段之一，同时，也广泛应用于真核生物基冈组功能的研究１５１。Ｃｒｅ重组酶是一种无需辅助因子进行位点特异性重组的生物酶，基因删除等研究领域并体现出巨大优势。本文概述了Ｃｒｅ重组酶的结构与功能、生物学应用潜力以及应用中存在的问题，并对其应用前景进行了展望。１Ｉ．ＩＥｒｅ重组酶的结构与功能Ｃｒｅ重组酶的结构与功能域Ｃｒｅ重组酶是由噬菌体Ｐ１基因组中大小为它的发现为基因靶位操作创造了有利条件。Ｃｒｅ酶介收稿日期：２００８—１２—２９基金项目：东北农业大学博十启动基金作者简介：吕涛（１９８２一），男，硕十研究生，研究方向为蔬菜乍物技术。＋通讯作者：王勇，副教授，硕士生导师，研究方向为蔬菜生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ａｃａｃｉａｗｙ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｌａ．ｃｎ万方数据　东北农业大学学报１０２９第４０卷ｂｐ的一段ＤＮＡ序列编码的蛋白质，由３４３基酸组成，包含有５个ｄ螺旋一螺旋Ａ、Ｂ、ｃ、Ｄ、Ｅ。反应过程中，螺旋Ａ不与ＤＮＡ接触，只是松散地同其他几个螺旋相连，它与重组过程中Ｃｒｅ重组酶四聚体的形成有关；螺旋Ｂ、Ｄ与ＤＮＡ的大沟相连，螺旋Ｂ与反向平行束的疏水面紧密接触；螺旋Ｃ未与ＤＮＡ分子相连；螺旋Ｅ在有剪切个氨基酸组成，分子质量为３８．５ｋｕ，属于整合酶家族的一员ｆ７】。其作用与酵母中的ＦＬＰ重组酶作用相似，但又有所不同。在体外状态下，无辅助因子、拓扑异构酶和ＤＮＡ不复制时也可发挥其生理作用。因这种ＤＮＡ重组过程容易在离体条件下发生，为研究Ｃｒｅ重组酶结构与功能关系提供了有利条件。Ｌｅ等发现，Ｃｒｅ重组酶的序列自身具有核定位信号肽（ＮＬＳ），因而它能进入真核生物的细胞核，这一过程不是简单的被动扩散，而是一种依赖于能量的主动运输的方式，这一特点和能力是许多原核蛋白所没有的口Ｉ。Ｇｕｏ等发现Ｃｒｅ重组酶是由两个明显的结构域活性的Ｃｒｅ亚基中与ＤＮＡ的骨架部分形成静电结合，在没有剪切活性的Ｃｒｅ亚基中它位于两个ｌｏｘＰ之间，螺旋Ｅ也参与了重组过程中Ｃｒｅ重组酶四聚体的形成。Ｃ一末端区块是Ｃｒｅ重组酶的主要活性中心ｆｌｏＪ，由第１３２至第３４１个氨基酸组成，共包含９个ｄ螺旋一螺旋Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ，螺旋间有两个小的口一折叠片结构。螺旋Ｊ与ＤＮＡ的大沟相连，是Ｃ一端唯一与ＤＮＡ大沟直接接触的部位；参与重组反应的Ｈｉｓ２８９、Ａｒ９２９２位于螺旋Ｋ上；螺旋Ｌ与螺旋Ｍ形成一个疏水区，在重组过程中有活性的氨基酸大多数均位于该部位，其中有切割活性酪氨酸（Ｔｙｒ３２４）位于螺旋Ｍ上，该部位也是Ｃｒｅ重组酶活性中心所在；螺旋Ｎ远离其他螺旋，有助于Ｃｒｅ亚基间相互接触。组成一较小的Ｎ一末端结构域和较大的ｃ一末端结构域，结构域间由一个短链相连（见图１）［８－９１。两个结构域在结合位点周同形成“夹子”结构，以和ＤＮＡ分子的大小沟部位充分接触【９】。在重组过程中，Ｎ一端和序列的识别有关系，为保守性较弱区域；而Ｃ一端和ＤＮＡ的结合及ＤＮＡ链的切割有关系，为整合酶家族强保守区。Ｎ一末端由第２０至第１２０个氨Ａ一单体Ｃｒｅ酶分子三维结构；Ｂ—Ｃｒｅ酶氨基酸组成及二级结构Ａ—ＴｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｍｏｎｏｍｅｒＣｒｅ；Ｂ－ＳｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＣｒｅ＋表示与ＤＮＡ接触的４２个氨基酸残基；ＲｅｇｉｏｎＩ和Ⅱ为Ｃｒｅ酶的核定位信号区域；小方框中的氨基酸残基为酶活性位点４ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ４２ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓＴｈｅｉｎｃｏｎｔａｃｔｗｉｔｈＤＮＡ；ＲｅｇｉｏｎＩａｎｄＩＩｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｔｅｓｉｇｎａｌｒｅｇｉｏｎｏｆＣｒｅｅｎｚｙｍｅ；ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｔｈｅｓｍａｌｌｂｏｘｆｏｒｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｚｙｍｅ图１Ｆｉｇ．１Ｃｒｅ重组酶的结构域ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅｄｏｍａｉｎｏｆＣｒｅ１．２Ｃｒｅ重组酶的理化特性及识别对象在理化特性上，Ｃｒｅ重组酶不仅具有催化活性，Ｃｒｅ重组酶的最适反应温度为３７℃，甚至在４６℃仍有活性，而ＦＬＰ在高于３９℃时就几乎检测不到活性，因此Ｃｒｅ重组酶适合在生长于这个温度范围而且同限制酶相似。其热稳定性较ＦＬＰ重组酶强，万方数据　第１２期吕涛等：Ｃｒｅ重组酶的研究进展内的宿主中使用，这一点在哺乳动物的遗传操作中已经得到广泛的应用ｎ１１。当Ｃｒｅ重组酶作用于核苷酸序列时，不需要其他蛋白质或ＤＮＡ等辅助因子的参与，也不需要额外消耗能量即可完成体内或体外的ＤＮＡ的重组；不但对底物的识别相当灵活，而且对底物的构形要求也不严格，可以是超螺旋ＤＮＡ，也可以是线性ＤＮＡ或者是环状的。Ｃｒｅ不仅可以识别ｌｏｘＰ的两个１３ｂｐ的反向重复序列和８ｂｐ的间隔区域，而且当一个１３ｂｐ的反向重复序列或者８ｂｐ的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组（见图２）。在Ｃｒｅ重组酶的作用下，两个反向ｌｏｘＰ位点之间的ＤＮＡ将会发生翻转；两个同向ｌｏｘＰ位点之间的ＤＮＡ片段将会被删除，并保留后面的ｌｏｘＰ位点ｉｌ¨４１。该特点使Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ位点特异性重组系统成为可在各类种属上进行意向ＤＮＡ操作的有用工具唧。５’ＡＴＡＡＣＴＹＣＧＴＡＴＡ———————————————————————————————————————————————●?Ｔ＾胛ＧＡＡＧＣＡＴＡＴ一ＡＴＴＧＴＡＴＧＣＡＣＡＴＡＣＧ图２Ｆｉｇ．２Ｃｒｅ重组酶识别的ｌｏｘＰ位点ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｉｏｘＰｓｉｔｅｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＣｒｅ到目前为止，科学家尚未在真核生物中发现类似的ＤＮＡ重组酶，所以我们可以直接利用Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统进行真核生物的转基因调控。需指出的是，Ｃｒｅ重组酶所催化的是一个可逆的重组事件，重组结果代表着正负反应的平衡，重组的程度与重组酶的表达水平相关【１５１。王立霞等对Ｃｒｅ酶做了部分删除，并发现其在缺失了前十几个氨基酸的情况下并不降低Ｃｒｅ对ｌｏｘＰ位点的识别和所进行的重组反应１１９１。Ｊｏｓｈｉ等对Ｃｒｅ酶的供给方式做了改进。他们开发了一种细胞渗透性Ｃｒｅ重组酶ＴＡＴＣｒｅ，该酶可以穿透细胞膜进入细胞内部发挥作用。在细胞培养的任一阶段，只需将该酶加入细胞培养液中就能够有效地诱导ＤＮＡ重组，而不必进行转基因操作或利用其他的遗传材料［２０ｌ。这对于大量设计有ｌｏｘＰ位点细胞的遗２Ｃｒｅ重组酶的突变分析和改造研究目前，已有很多研究通过改变Ｃｒｅ酶上的某些氨基酸位点等方法来研究其结构及功能上的变化。传调控将大有益处。但此方法能否被改造并用于植物悬浮细胞中则有待进一步研究。Ｒｕｌｅｒ等通过ＤＮＡ改组技术针对特异型ｌｏｘＰ位点—１０ｘＫ２对野生型Ｃｒｅ重组酶进行改造１２１Ｊ。在众多的突变体中分离到一种能够对ｌｏｘＫ２进行有效重组的突变Ｃｒｅ—ｒ３ｍ３，其效率几乎与野生型Ｃｒｅ酶对ｌｏｘＰ的重组效率相当，而且该突变体依然具有对ｌｏｘＰ的较高重组能力。这将进一步延展出新型的Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ重组系统组合。Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋｉ等通过诱变分析研究，对酶分子活性区域的氨基酸进行突变，结果发现Ｃｒｅ酶活性丧失或降低；而在远离活性中心、距Ｎ一端较近的部位，将Ａｒｇ突变为Ｃｙｓ。酶的重组活性较野生型提高了１５％【１同。Ｓｈａｉｋｈ等研究得到３个Ｃｒｅ的突变体，将Ａｌａ３６突变为Ｖａｌ、ｒｒｈｒ４１突变为Ｐｈｅ、Ｇｌｙ３１４突变为Ａｒｇ，结果发现这３个突变体均不能进行ＤＮＡ链的切割【１７１。Ｇｕｏ等为了获得一个稳定的Ｃｒｅ—ｌｏｘ复合物，以观测其结构，设计了．Ｃｒｅ酶的两个突变体：ＣｒｅＹ３２４Ｆ和ＣｒｅＲｌ７３Ｋ，同时以与ｌｏｘＰ有两个碱基对不同的ｌｏｘＳ做为底物，它们也都能够形成一个中间产物，但是不能切割【１８１。Ｓｈａｉｋｈ等设计了３个Ｃｒｅ突变体：ＣｒｅＡ３６Ｖ，ＣｒｅＴ４１Ｆ．ＣｒｅＧ３１４Ｒ。这３个突变体都不能执行链的切割功能，但是将它们与缺乏Ｔｙｒ的，具有切割功能的Ｃｒｅ蛋白混合，则可获得切割功能∽。３Ｃｒｅ重组酶的应用潜力Ｅｒｅ酶能够特异性的识别ｌｏｘＰ位点而使ＤＮＡ分子发生重组，但Ｈｏｅｓｓ等发现当其与野生型ｌｏｘＰ位点或其他已突变型ｌｏｘＰ位点串联在一起时同向排列的ＤＮＡ分子则很难被切割阎。目前，针对新型ｌｏｘＰ位点的研究与应用业已相继展开，对于新型ｌｏｘＰ位点和相应野生型Ｃｒｅ酶及其突变体的体内重万方数据　’１２８‘东北农业大学学报第４０卷组情况进行检测成为必需［ｚ３－ｚ．ｑ。Ｃｒｅ重组酶通过对ＤＮＡ进行准确切割和重新连接，使得在染色体水平对真核生物基因组进行遗传改造，以及对转基冈动物和植物中转基因的表达进行有效的控制成为可能。这是由于Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ定位重组系统具有高效性、时间和空间特异性、准确性和快速性的特点例。尽管各种新型重组酶近年来不断被发现．旧的重组体系不断被更新，但是Ｃｒｅ重组酶系统仍然以它自身的显著优点在重组技术中起着重要积极的作用。目前，Ｃｒｅ重组酶介导的位点特异性重组体系的优点主要体现在以下六个方面：①特异性的外源基冈整合位点；②删除转基因生物标记基因；③获得单拷贝或者接近单拷贝的外源ＤＮＡ；④外源基因在不同株系中的定点易位交换；⑤特定组织器官或发育时期删除转入的外源基因；⑥多次重复使用同一特定位点进行基冈叠加等［２６１。４Ｃｒｅ重组酶介导的位点特异性重组在植物基因工程中存在的问题Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ位点特异性重组系统是应用较广泛、删除效率相对较高的一类重组系统。但该系统也存在明显不足：由于获得完整的重组系统往往需要通过杂交或二次转化等方式，故删除标记基因的过程漫长。为解决上述问题，一些科学家试图通过瞬间表达或化学诱导等方式来调控重组酶基因的表达，以缩短删除标记基因的时间，但这些方法的可操作性较差，重复性也不好∞制。另外，现有这些技术主要关心的是删除转基冈植物中的筛选标记基因，而对于改良作物品质、增加作物产量以及提高作物能后并没有从转基因植物中删除，这些基因仍然可能逃逸到自然界中，对生态环境和人类健康构成威在自然宿主中，Ｃｒｅ蛋白在不同的时期都可以表达，因此接触Ｐｌ处于溶源状态的大肠杆菌等就会接触到Ｃｒｅ蛋白。为了评价Ｃｒｅ蛋白的安全性，必氨基酸序列与过敏原或者毒素蛋白序列的相似性。因为Ｃｒｅ蛋白不应该存在于转基因植物中，还需要万　方数据５展望随着对ｃｒｅ研究的不断深入，在未来对于Ｃｒｅ应用会取得更进一步的发展。如果能与ＦＬＰ酶联合使用，可能会给基因重组研究带来新的前景。此外，将重组技术简单化，使一般实验室均能操作，也会促进定位重组系统的普及。［参考文献］Ｒ，ＡｂｒｅｍｓｋｉＫ，ＳｔｅｒｎｂｅｒｇＮ．ＴｈｅｎａｔｕｒｅｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰＩｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅＣｒｅｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇｓｉｔｅｌｏｘＰ［Ｊ］．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＳｙｍｐＱｕａｎｔＢｉｏｌ，１９８４，４９：７６１２－７６８１．ＲＨ，ＷｉｅｒｚｂｉｃｋｉＡ，ＡｂｒｅｍｓｋｉＫ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｔｈｅｌｏｘＰｓｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎｉｎＰ１ｓｉｔｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９８６，１４：２２８７—２３００．Ｄ，ＡｎｄｒｅｗｓＢＪ．ＲｏｂｅｒｔｓｅｂｅａｔｔＹＬ＇ｅｔａ１．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏ－ｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｙｅａｓｔ２２ｍｉｃｒｏｎＤＮＡｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９８３，８０（２３）：２８４２－２８８１．ＪＳｃｈｗｅｉｚｅｒＨＰ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＦｌｐ－ＦＲＴｓｙｓｔｅｍｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．ＪＭｏｌＭｉｅｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｅｈｎ０１．２００３，５（２）：６７２－７７１．ＮＪ，ＳｎａｉｔｈＭＲ，ＭｕｒｒａｙＪＡ．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ．－ｔｏｏｌｓｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｎｇｌｎｅｅｒｉｎｄＪ｝．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔｉｃ，１９９３，９０２）：４１３－－４２１．Ｈ，ＺｏｕＹＲ，ＲａｊｅｕｓｋｙＫ．Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｏｎｔｒｏｌｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕ－ｌｉｎｓｗｉｔｃｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｔｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｗｉｔｃｈＦｅｇｉｏｎｓｅｖｉｄｅｎｃｅｄｔｈｒｏｕｇｈＣｒｅ—ＬｏｘＰ—ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９３，７３（６）：１１５５—１１６４．及其一步纯化和活性检测ｍ北京林业大学学抿２００６，２科５为的ＹＺ，ＧａｇｎｅｔｅｎＳ，ＴｏｍｂａｅｅｉｎｉＤ，ｅｔａ１．Ｎｕｃｌｅａｒｔａｒｇｅｔｉｎｇｄｅｔｅｒ－ｍｉｎａｎｔｓＰＩＣｒｅＤＮＡｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮｕｄｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ，１９９９，２７（２４）：４７０３－４７０９．Ｆ，ＧｏｐａｕｌＤＮ，ＤｕｙｎｅＧＤ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｅｄｗｉｔｈＤＮＡｉｎａｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｙｎａｐｓｅｌＪ］．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７．３８９：４０—４６．１７（１８、：４７３－４７９．１】ＢｕｃｈｈｏｌｚＦ，ＲｉｎｇｒｏｓｅＬ，ＡｎｇＴａｎｄＰＯｅｔａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｈｅｒｍｏｓ—ｔａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆＦＬＰａｎｄＣｒｅｒｅｅｏｍｂｉｎａｓｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒａｐｐｌｉｅｄｓｉｔｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，２４（２１）：４２５６—４２６２．【１］Ｈｏｅｓｓ【２】Ｈｏｅｓｓ【３】Ｖｅｔｔｅｒ抗性等外源基冈以及重组酶基因本身，在完成其功胁例。这也限制了位点特异性重组系统在实际生产上的应用。须研究消化道环境中Ｃｒｅ蛋白的降解速率、比较其进行动物饲喂实验，目前尚未有这方面的数据。（４【５】Ｋｉｌｂｙ【６】Ｃｕ【７】王文棋，盖颖，陆海，等．重组酶Ｃｒｅ基因在大肠杆菌中的高效表达【８】ｋ【９】Ｇｕｎ［１０】王敏秀．Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统在重组伪狂犬病病毒中的应用【Ｊ】２００５，［１