中药及其制剂分析概论

（2）供试品溶液的制备：中药制剂组成复杂，成分的性质差异较大，另外待测组分的含量较低，因此在进行HPLC分析前，一般需要对样品进行预处理，比如提取分离、纯化处理、浓集样品或进行衍生化处理等，样品的预处理是中药及其制剂分析的重要保证。对于组成复杂的制剂，仍需采用萃取法或柱色谱等预处理方法对供试品进行纯化处理。中药制剂中多含有糖等附加剂，制备供试品时，宜使用高浓度的醇或其他有机溶剂提取测定组分，最好不使用水为溶剂，以免提出的糖污染色谱柱，提取方法视制剂的情况而定。也可采用萃取(用于液体制剂)、回流或超声振荡提取(用于固体制剂)等方法。

中药制剂组成复杂，测定时应在分析柱前加一预柱。进样前，需用滤膜抽滤或针头过滤(0.45um)，分析完毕后一般用水或低浓度的醇水先洗去糖等水溶性杂质，再用甲醇等将色谱柱冲洗干净。

（3）含量测定方法

外标法：若校正曲线过原点，测定组分含量变化不大，可使用外标一点法。由于中药制剂中待测组分含量的波动范围较大，所以最好采用校正曲线法定量。

内标法：中药制剂组成复杂，若使用内标法，会增加分离的难度，其他成分很容易干扰内标峰，所以中药及其制剂的含量测定j一般情况下不提倡使用内标法，当制剂中组成相对简单，杂质不干扰内标峰时，才能使用内标法定量。

案例[2] HPLC法测定复方丹皮汤中丹皮酚的含量 精密称取丹皮酚对照品1.34 mg,P20。置干燥器P2O5干燥器中干燥24h,至25ml容量瓶中，用50％色谱甲醇定容至25ml,即得对照品溶液。备将含牡丹皮40g的复方丹皮汤4袋，置500ml容量瓶中，用水定容至刻度线。取lml置25ml容量瓶中用50％甲醇定容置刻度线，摇匀，用0.45mm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。根据处方组成，取除牡丹皮外的其余药材，按工艺要求制成缺牡丹皮的阴性制剂按供试品溶液制备方法，制得牡丹皮阴性对照溶液。 色谱条件色谱柱：岛津(VP-ODS柱4.6 mm×150mm)；流动相：甲醇-水(50：50)；流-1速：1.OOml·min；检测波长：274 nm；柱温：3℃；进样量：20uL。见图15-6.

A

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B

C

图15-6 复方丹皮汤HPLC图 A.对照品 B.供试品 C.阴性对照

2 气相色谱法：

气相色谱法主要用于测定制剂中含挥发油及其他挥发性组分的含量，如冰片、桉叶素、樟脑、厚市恸、丁香酚、龙脑等；还可用于中药及其制剂中含水量或含醇量的测定，如天麻丸、六神丸、人丹等制剂中含水量和藿香正气水含醇量的测定。

(1)实验条件的选择

固定相：气液色谱中固定相由固定液和载体组成。固定液按极性相似或化学官能团相似的原理进行选择，对复杂样品的分析可使用混合固定液。载体为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理的硅藻土。中药制剂分析中气固色谱的固定相大多采用高分子多孔微球(GDX)，用于分离水及含羟基(醇)化合物。

柱温：柱温对分离度影响很大，是分离条件选择的关键。选择的基本原则是：在使难分离组分有符合要求分离度的前提下，尽可能采用较低的柱温，但以保留时间适宜及不拖尾为度，同时注意柱温要低于固定液的最高使用温度。

载气：选择载气主要从对峰宽(柱效)、柱压降和检测器灵敏度的影响三方面考虑。热导检测器应选用H2、He；对氢焰检测器和电子捕获检测器一般采用N2，N2是最常用的载气。

检测器：用于中药制剂分析的检测器有热导检测器(TCD)、氢焰离子化检测器(FID)、

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氮-磷检测器(NPD)和电子捕获检测器(ECD)。其中FID是制剂分析中应用最广泛的质量型检测器，适用于咨碳有机物的测定。NPD为专属性检测器，对含N、P有机化合物特别的灵敏，可用于中药及其褂剂中农药残留量的检测。ECD也是一种专属性检测器，适用于含卤素、硫、氧、硝基、羰基和氰基等化合物的分析。 （2）测定方法的选择

气相色谱常用的定量方法有内标法、外标法、归一化法等。

内标法：中药及其制剂含量测定最常用的方法。适用于样品的所有组分不能全部流出色谱柱，或检测器不能对每个组分都产生信号或只需测定样品中某几个组分含量时的情况。内标法对进样量的一致性，进样速度等操作要求不高，因而适合于中药及制剂中某些有效成分或微量杂质的含量测定。内标法可抵消仪器稳定性差，进样量不够准确等原因带来的误差。不足之处是样品的配制较麻烦，有些内标物不易找到，内标法又分为内标加校正因子法、内标对比法及内标工作曲线法。

外标法：外标法操作简便，计算方便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对被测组分定量，但要求进样准确及实验条件恒定。外标法又分为工作曲线法及外标一点法等。

归一化法 归一化法的定量结果与进样的重复性无关，操作条件略有变化对结果影响较小。但其缺点是要求所有组分均要产生色谱峰，不适于微量杂质的含量测定。

3薄层色谱扫描法

薄层色谱扫描法(thin layer chromatography scanning，TLCS)系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光和可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定的一种方法。根据薄层扫描方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法两种。薄层色谱扫描法具有分离效能高、简便快速等特点，因而适用于中药制剂的分析，本法的准确度和精密度虽不及高效液相色谱法，但可以作为高效液相色谱法的的分析的补充，用于无紫外吸收或不能采用高效液相色谱法分析的组分。如人参皂苷、贝母生物碱和黄芪甲苷等。 （1）实验条件的选择

色谱条件：首先应选择好薄层色谱条件，在选定条件下组分应能完全分离，斑点对称，均匀，不拖尾，这是取得准确测定结果的先决条件。

测量方法：根据光测定方式可分为反射法和透射法，反射法是将光束照射到薄层斑点上，测量反射光的强度；透射法则是测量透射光的强度。在薄层扫描法中大多采用反射法，

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反射法受薄层厚度影响较小，基线较稳，因而应用较多。透射法受薄层厚度影响较大，且玻璃对紫外光有吸收，所以实际应用较少。

检测方法：有吸收测定法和荧光测定法两种。在可见、紫外区有吸收的组分，采用吸收测定法测定。有荧光的组分，可选择好激发光波长（λex）和发射光波长（λem）,用荧光法测定。荧光法具有专属性强、灵敏度高和线性范围宽等特点。

扫描方法：根据光学系统的不同，扫描方法又可分为单波长扫描或双波长扫描，定量分析时一般采用双波长扫描法。双波长扫描法是采用两束不同波长的光，一束测量样品为测定波长(λs)，另一束作为对照，称为参比波长((λR)，两束不同波长的光通过斩光器交替照射到斑点上，以吸光度之差△A进行定量。单波长扫描法通常用于斑点吸收光谱的测定。

（2）测定方法的选择

薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，供试品与对照品同板点样、展开、扫描、测定和计算。

外标法：外标法是薄层色谱扫描法最常用的定量方法，方法简单，但点样必须准确。由于薄层板间的差异较大，为克服这一差异，应采取随行标准法，测定时将供试品和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上。若标准曲线经过原点，可用外标一点法定量，只需点一种浓度的对照品溶液，与供试品溶液同板展开测定。若标准曲线不通过原点，通常采用线性回归二点法计算，如线性范围很窄时，可采用多点法校正多项式回归计算。供试品和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，供试品点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少于2个。

内标法：内标法是将内标加入到供试品和对照品溶液中，以其峰面积的比值作为定量的依据，目前应用较少。

4 分光光度法

分光光度法在中药制剂分析中也有应用，但由于中药制剂成分复杂，不同组分的紫外吸收光谱往往彼此重叠，因此在测定前必须经过提取与纯化等步骤，以排除干扰。同时应取阴性对照品在相同条件下测定，应无吸收。常用的几种形式：

对照品比较法：按各品种项下的方法，分别配制样品溶液和对照品制成对在相同条件下测定，根据下列公式计算样品的浓度。

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