整理分子生物学课件重点 - 图文

基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译；在个体发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调控），并随着内外环境的变化而不断的加以修正（环境调控）。

是将不同的DNA片段（如基因或基因的一部分）按照人们的设计定向的连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 克隆的理性思考

? 培植人类胚胎细胞的计划会最终导致大量地复制人类吗? 当人类的繁衍不是靠自然的生育，却是靠高科技手段,以流水线作定型复制，那么人类还能叫自然人类吗？到那时,地球又该用怎样的方式来接纳这批人类的复制品呢？

复制 一、DNA合成的化学基础：

2个关键的底物：（1）4种脱氧核苷三磷酸—dGTP、dCTP、dATP、dTTP。 （2）引物：与模板互补，比模板短的一小段序列，暴露的3’-OH。

DNA通过引物3’端的延伸进行合成

二、DNA聚合酶的作用机制

DNA聚合酶优先添加正确配对的dNTP 空间位阻阻止DNA聚合酶催化反应使用rNTP DNA聚合酶是一种延伸酶 外切核酸酶校正新合成出的DNA DNA聚合酶：

DNA聚合酶是DNA合成中起主要作用的酶，催化总反应

(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + ppi

DNA 延伸的DNA

DNA聚合酶I具有：

5’ ------ 3’聚合活性

3’ ------- 5’外切酶活性(校阅作用 Proofreading) 5’ ------- 3’外切酶活性

DNA聚合酶的关键特征：

忠实性(Fidelity)

DNA聚合酶的聚合活性和3’ - 5’的校阅活性保证了DNA合成的精确

性

催化效率

DNA聚合酶催化活性依赖于聚合酶的延伸能力(Processivity) 三、复制叉

复制叉上DNA的两条链同时合成

DNA新链的起始需要一条RNA引物（由一种特殊的RNA聚合酶，引物酶引发） 完成DNA复制必须除去RNA引物 DNA解旋酶在复制叉之前解开双螺旋 复制前单链结合蛋白使单链DNA稳定 滑动夹增加了DNA聚合酶的延伸能力 滑动夹是通过滑动夹装载器打开并安置在DNA的引物-模板接头上 四、复制叉上的DNA合成

1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ简写DNA polⅠ，后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ，大肠杆菌中至少有5种DNA聚合酶。

? 大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNA polⅢ起作用，而DNA polⅠ用于除去RNA引物和合成较短的DNA片段。DNA polⅡ在DNA的修复中起作用。

真核生物DNA聚合酶：

真核细胞通常有15种以上的DNA聚合酶，其中α、δ及ε在DNA复制中起主要作用，γ在线粒体DNA的复制中起作用，其他的大多参与DNA的修复。 DNA聚合酶Ⅲ全酶：

大肠杆菌复制叉上用于协调两种DNA聚合酶复制的长号模型 复制叉蛋白之间的相互作用形成E.coli的复制体 五、DNA复制的起始 DNA复制过程的三个阶段

? DNA复制的起始阶段，包括起始点，复制方向以及引发体的形成。 ? DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。

? DNA复制的终止阶段。

单向复制和双向复制；滚环式复制Φχ174；D-loop复制方式 线粒体DNA复制 DNA复制的起始阶段

? 复制是从DNA分子上的特定部位开始的，复制起始点(originof replication)常用ori或o表示，称为复制子或复制单元(replicon)。 ? 在原核细胞中只有一个复制起始点，一个复制子。

? 在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有多个复制子。

真核生物中DNA的复制特点：

1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子

2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 3、真核生物有多种DNA聚合酶。 聚合酶链式反应（PCR）技术：

聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。

PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。 PCR技术的原理：

首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。

? DNA解链（变性）

? 引物与模板DNA相结合（退火） ? DNA合成（链的延伸）三步。

经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得1.8n. 将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（>94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA

降低反应温度（退火，约50℃），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。

将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，

从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链。

常规PCR技术能扩增两引物之间的DNA区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序列，这就需要应用反向PCR（reverse PCR）技术。 先用一种在靶DNA区段上没有识别位点的核酸内切限制酶，从距靶DNA区段有一定距离的两侧位置切割DNA分子，然后将这些片段作分子内连接成环形。根据已知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的未知DNA序列。

反向PCR的基本操作程序。波纹线表示靶DNA区段，箭头表示限制性内切酶位点，分别用方框表示靶DNA区段的左侧和右侧序列。

? 用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化DNA； ? 产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过2~3kb，经连接后重新环化；

? 按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指； 转录

一、依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP)

① 以DNA为模板，以四种三磷酸核苷为底物，转录的方式是不对称的。 ② RNA链的延长方向是5’→3’的连续合成。 需要Mg2+或Mn2+。RNA聚合酶缺乏3’→5’外切酶活性，不需要引物 。 原核生物RNA聚合酶：

细菌全酶由六个亚基组成，去掉δ亚基的部分称为核心酶（α2ββ’ω ） 亚单位 分子量 亚单位数 功 能

α 36512 2 决定哪种基因被转录 β 150618 1 与转录全过程有关

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