MTT实验指导-大汇总 (2)

解决方法4：加入DMSO

在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净，没有去掉

上清直接加DMSO，一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜色在检测时也能被测到，会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉，因为这样带来的误差要远远

大于培养液没弃干净带来的误差，所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.

1. 加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5-10min， 时间控制尽量严格一点，放置时间长了会影响结果，值会偏大，且结果不可信.

2. 加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。

3. 或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。

振荡是为了让甲臜溶解，这样才能更好的测量吸光度，振荡96孔板有专的振荡器，目的：扎破气泡.有气泡存在时，由于其对光的反射与折射作用（酶标仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度），会导致结果偏移.

OD值的测定

至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值，而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO，它的测定波长是570。（就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选用TMB显色液则用450）；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。

DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而SDS做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变.

细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染，空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。

复孔直接的OD值差别一般应在0.1-0.15，差别太大考虑：1.接种细胞数不均匀，或是

接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔1000-10000个。可以细胞细胞计数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。2.贴壁时间：18-24h，如果不够，悬浮的细胞会被吸掉。

一般为了实验的准确，每个浓度可以设5-6个复孔，可以最后统计时，可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现与细

胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确，在37℃，

5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（1-4小时）等有密切的关系，当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！（一般开机预热20min）。

MTT方法的吸收度在0.2~0.8之间误差较小。这和分析化学中的lambert-beer定律有关， 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲）。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。

在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.2~0.8之间，才能保证测量的相对误差较小。当A=0.434（或透射比T=36.8%）时，测量的相对误差最小。

其它的声音：

1. 最好用570nm波长的滤光片，因为MTT在这个波长的吸光度是峰值，换句话说灵敏度高。用其它波长的也有，一般是490nm，但我的经验灵敏度降低一半。

2. 我们用的BIO-TEK公司的ELx800，一般值在2以下都是可靠的，如果复孔之间值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差. 我曾经看到园子的有些帖子报道说OD值大概在0.2-1.2范围内与活细胞数有较好的线性关系，但OD值在0.3-0.9范围内可能更佳，若

你的OD值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适，应调整你的细胞数。

边缘效应

96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高或偏低，96

孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，由于温度梯度使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。解决方法：将孔板周围的一圈孔全部不用，影响非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培养液，只要能防止蒸

发就可以.

关于如何计算IC50

（1）改良寇式法：lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4） Xm：lg 最大剂量

I：lg（最大剂量/相临剂量） P：阳性反应率之和 Pm：最大阳性反应率 Pn：最小阳性反应率

举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入

计算公式： Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025 IC50=0.00025

（2）Bliss法：自己查阅书籍

（3）IC50计算软件，见下面附件

（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！

（5）在线求IC50或EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

结果统计学处理

所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组

excel表中可以做两两比较的T-test，这个你可以参考一下；你的数据应该用多个样本均数的T-test，方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。

孔板的重复利用：

培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。建议不要用太多次，即使是进口的板子使用次数也不要超过3次，底值最好在测得值的1/3一下。

强烈建议培养板不要重复使用：1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长，会出现帖壁不好，细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底，如果有万一，则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质.

重复利用时 做法1：

洗净后用2%NaoH浸泡4小时，再用1%稀盐酸浸泡4小时，冲洗15遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干，UV照射过夜（紫外2小时以上消毒即可）

做法2：

泡酸2-4小时，老师让我们别超过4小时，（普通的玻璃仪器是过夜）。捞出，冲洗干净，烘干后，UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起，钴60照射消毒。

做法3：

1. 做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。

2. 用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干。

3. 重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液（六小时以上即可）后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理。

4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干。

5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。 做法4：

1、测完值的96孔板甩掉孔内培养液，放入超声中超10-30分钟，晾干（或烘干）备用。 此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。

2、每孔加入50-100ul的胰酶（0.05%），我一般加60ul，加完胰酶后水平振荡96孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面，室温下放置至细胞被消化脱落为止。假如你想消化快一点的话可将96孔板放到37度培养箱内（胰酶在37度时的活力最大）。 对于顽固贴附在壁上的细胞，此步骤最为有效。

3、甩掉胰酶，自来水下冲洗，晾干（或烘干）备用。

如果不烘干就泡酸，那么96孔板残留的水分将稀释酸液，长期以往泡酸的效果下降。 4、将晾干的96孔板泡酸（中强酸）过夜，捞起后自来水下冲洗10遍；双蒸水冲洗3遍。三蒸水冲洗3遍。烘干备用。泡酸时特别注意时间不要太长了，否则板子变黄，影响最后的OD值的测定。

5、做实验前，96孔板至少在紫外灯下照射30分钟，但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄，我的两块板放在超静台上忘了拿出来，一直照了两个星期，等我从超静台上取出板已经变成黄色。 注：

1、在实验中若你测得某一个孔的数值偏高，虽然有很多因素会导致数值偏高，但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再测值。你会发现孔高的值又会到正常水平。因为咱们做实验时手不可避免的接触96孔板板底留下痕迹，这些痕迹就会使吸光度升高。

2、96孔板洗的次数多了，板底自然留下划痕，这就会导致读数的不均而影响实验结果。你不妨在做实验前测一次96孔板的值（此值为初值），实验测得的为后值。后值减去初值就接近实验的真实值。

MTT实验心得

MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。

1、培养好细胞点板。

养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的

名字，就可以上www.atcc.org检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时每孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大。

2、点板布局。

其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。

3、加MTT。

如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。

4、加入MTT后的反应。

时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒：如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。至于DMSO的体积差异不同为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我不多说，如果有人不明白我再证明给他看。当然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好。

5、检测MTT。

还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。

6、吸收值分析。

在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，

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