可用于基因功能研究的基因组学工具——诱变(11)

可用于基因功能研究的基因组学工具——诱变

234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 座位点杂交，采用基于mariner家族的Himar1转座子和有效的噬菌体转导系统产生灰色分枝杆菌突变体大文库。获得的突变体再通过丰富培养基和基本培养基来比较生长状况。提取在两种培养基上存活的菌落的基因组DNA，通过合成与每个染色体上转座子两侧序列互补的标记RNA探针，然后杂交，来鉴定插入位点。这些探针与带有灰色分枝杆菌的每一个预测的基因组上ORF片段的芯片杂交，通过比较来源于两种培养基上的突变体的杂交信号，来确定那些在基本培养基上生长所需要，但在丰富培养基上生长不必要的灰色分枝杆菌基因，这些基因是由已知和未知功能的基因组成的（Sassetti 等, 2001）。 尽管体内方法是有力的工具，并可用于研究任何一种其遗传系统已被开发并测序了的微生物，但不适合大多数研究，因为在统计学上要获得关于基因必需性的重要结论，需要大量的转座子插入。而且，并不是每一个转座子插入到一个基因就导致一个无义突变，因为许多靠近3’端的插入只缺失蛋白的不必要的羧基末端部分。当转座子插入到5’端时，转座子上朝外的启动子的存在也能驱动整个ORF的转录。因此，体内反向方法的主要缺点在于体内转移本身的靶特异性和效率。由于每个基因组中存在“热点”和“冷点”，要获得某些区域的高密度突变非常困难。因此，这种方法只能被用于基因必需性的初步预测，由此产生的任何结果都需要进一步的验证。 通过体外转座来分析基因组并进行图谱定位 用体外转座还开发了一种方法，可以允许更大密度的转座子插入并用于必需基因的反向选择（Akerley 等, 1998; Reich等, 1999）。这种方法，也就是通过体外转座来分析和定位基因组（GAMBIT），该法对研究那些自然环境中能够接受突变片段的感受态微生物的基因必需性特别有用。这类方法包括大片段的饱和突变，这些大片段最后整合到宿主基因组中，产生一个转座子突变体的综合文库（图8.2）。PCR扩增的染色体片段用于体外突变，形成每一个ORF都含有多个突变的重组DNA分子群体。随着转入宿主体内之后，突变的等位基因通过同源重组和产生突变整合到染色体上。产生的突变全部通过基因功能进行筛选，然后选择性筛选之前和之后从文库中提取DNA样品，每个样品中的代表突变再用基因组指纹图谱分析（Singh 等，1997），包括用转座子特异和ORF特异引物进行PCR扩增。设计这种方法可以

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