现代生物科技专题
(时间：40分钟 满分：100分)
1．(16分)(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
解析：(1)据图示信息分析：将L1-GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1-GFP融合基因的完整，又能保证L1-GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
答案：(每空2分，共16分)(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞 (4)核DNA
2．(10分)(2019·广东省实验中学高二联考)CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是近年来颇受关注的一项新技术。该基因表达系统主要包含引导RNA和Cas9蛋白两个部分，引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图用CRISPR/Cas9系统对水稻产量基因Q基因进行编辑，请回答下列问题：
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(1)研究发现，CRISPR/Cas9仅存在于原核生物，故需借助________技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9蛋白与________酶的功能相似。
(2)首先依据________的部分序列设计DNA片段A(负责编码相应引导RNA)，再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体(如图所示)。位点Ⅰ、位点Ⅱ分别表示________酶切位点。
(3)质粒B大小为2.5 kb(位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60 b)，经酶切后的片段A大小为0.5 kb(千碱基对)，连接形成的表达载体大小为________kb。
(4)常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入到Ti质粒的________上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到____________________，从而使其得以维持稳定和表达。
(5)CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，试从引导RNA的角度分析脱靶的原因________________。
解析：(1)若将原核生物的基因导入真核生物中并表达，需要利用基因工程技术。根据题干信息Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，说明Cas9蛋白与限制酶的功能相似。
(2)由于是对水稻产量基因Q基因进行编辑，故首先需要依据Q基因的部分序列设计DNA片段A(负责编码相应引导RNA)，再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体(如图所示)。根据片段A两端的限制酶种类以及片段A连接在位点Ⅰ、位点Ⅱ之间，可知位点Ⅰ、位点Ⅱ分别表示Kpn I和BamHⅠ的酶切位点。
(3)质粒B大小为2.5 kb(位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60 b)，经酶切后的片段A大小为0.5 kb(千碱基对)，连接形成的表达载体大小为2.5＋0.5－0.06＝2.94(kb)。
(4)常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞， 由于农杆菌的Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故可将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到水稻细胞染色体的DNA上，从而使其得以维持稳定和表达。
(5)由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合，从而
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导致CRISRP/Cas9基因编辑技术会出现编辑对象出错而造成脱靶。
答案：(除特殊说明外，每空1分，共10分)(1)转基因(或DNA重组、基因工程) 限制 (2)Q基因 KpnⅠ、BamHⅠ(2分)
(3)2.94 kb (4)T-DNA 水稻细胞染色体的DNA上
(5)其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而脱靶(2分) 3．(10分)(2019·石家庄市高三二模)乙型肝炎病毒(HBV)可引发慢性肝炎、肝硬化等疾病，乙型肝炎病毒调节蛋白HBx对HBV复制有重要作用。图1表示在PCR过程中HBx基因与引物的关系，图2表示利用中国仓鼠生产乙肝病毒HBx蛋白的流程图。回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增图1中HBx基因时，在第________次循环结束后即可出现两条链等长的目的基因片段。图2中②过程需要用到限制酶和DNA连接酶，两种酶作用于________(填“相同”或“不相同”)的化学键。
(2)基因表达载体导入受精卵常用________法，检测HBx基因是否转录出mRNA时，需要用________做探针，再与相应的物质杂交。
(3)④过程体外受精前需要对精子进行________处理，卵母细胞需要发育到________期，才具备与精子受精的能力。⑤过程将获得的早期胚胎移植到经过________处理的受体仓鼠子宫内。
(4)在⑤步骤操作前对胚胎进行了检查和筛选，发现有些胚胎因为外源基因的插入而死亡，外源基因插入导致胚胎死亡的原因可能是_____________ ____________________________________________________。
解析：(1)第一次复制形成的子链比含HBx片段的一条链要短，以此子链为模板再进行复制，形成的子链正好和HBx的一条链一样长；再由和目的基因一条链一样长的子链为模板进行复制，形成的双链DNA片段才是目的基因片段，所以至少经过3次循环复制。限制酶和DNA连接酶作用的部位均为磷酸二酯键。
(2)基因表达载体导入受精卵常用显微注射法。检测HBx基因是否转录出mRNA时，所用的探针为标记的目的基因。
(3)精子在体外受精前需进行获能处理，且卵母细胞需发育到MⅡ中期。为保证供体和受体的生理状态相同，应对受体仓鼠进行同期发情处理。
(4)胚胎的死亡是由于外源基因的插入所致，由此可推知插入的外源基因可能导致原来胚胎发育所需基因不能表达，从而导致胚胎死亡。
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答案：(除特殊说明外，每空1分，共10分)(1)3 相同
(2)显微注射 放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段(答出标记的目的基因即可)(2分)
(3)获能 MⅡ中 同期发情
(4)外源基因的插入导致胚胎正常发育所需的基因不能表达(意思对即可给分)(2分) 4．(10分)(2018·海南高考)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜________(填“受伤的” 或 “完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共同培养，选用这种叶片的理由是____________________________________________。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中________已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到________(填 “核基因组”“线粒体基因组” 或 “叶绿体基因组”)中。
(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用________作为外植体进行组织培养。
(4)通常，基因工程操作主要有 4 个步骤，即目的基因的获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为____________________。
解析：(1)黄瓜受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类物质化合物，吸引农杆菌移向这些细胞。
(2)甜蛋白是由甜蛋白基因指导合成的，若转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达。子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，说明其遗传遵循孟德尔分离定律，因此甜蛋白基因已经整合到核基因组中。
(3)研究发现植物分生区附近(如茎尖)的病毒极少，甚至无毒，因此组织培养时应选用一定大小的茎尖作为外植体进行组织培养。
(4)基因工程是指按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。
答案：(除特殊说明外，每空1分，共10分)(1)受伤的 叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞(3分)
(2)甜蛋白基因 核基因组 (3)茎尖
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(4)按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型(3分)
5．(12分)(2019·武汉市高三模拟)克隆猴是我国科学家用体细胞克隆出的世界首例灵长类动物，其步骤如下：
(1)进行体细胞核移植前，从具有优良性状的B猴体中取体细胞进行培养，培养条件除营养、温度和pH适宜外，还应保证________________________(答出3点)。核移植前还需对A猴的卵母细胞进行去核操作，其目的是____________________________。
(2)经核移植得到重组细胞后，一般还需经过________和胚胎移植。为使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致，需要对供、受体母猴用激素进行________处理。
(3)体细胞的细胞核必须被移植到去核卵母细胞后才能表现出全能性，原因主要是_______________________________________。
根据这一启示，请提出一种恢复体细胞分裂分化能力的新思路： _____________________________________________________。
解析：(1)动物细胞培养的条件有营养条件、无菌、无毒、适宜的环境条件(包括温度、pH及适宜的气体环境)等。图示中的A猴为雌性，应去核，目的在于保证核移植的胚胎或动物的遗传物质主要来自供体B猴。
(2)经核移植得到重组细胞后，一般还需经过早期胚胎培养和胚胎移植。为使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致，需要对供、受体母猴用激素进行同期发情处理。
(3)去核卵母细胞的细胞质中含有促进细胞核全能性表达的物质，因此供体的细胞核需移植到去核卵母细胞中。由此可知，从卵母细胞中分离出能促进细胞核全能性表达的物质，将其导入到体细胞中，可以使体细胞恢复分裂分化能力。
答案：(每空2分，共12分)(1)无菌、无毒、适宜的气体环境 保证核移植的胚胎或动物的遗传物质主要来自供体
(2)早期胚胎培养 同期发情
(3)卵母细胞的细胞质中含有促进细胞核全能性表达的物质 从卵母细胞中分离出能促进细胞核全能性表达的物质，将其导入到体细胞中
6．(14分)(2019·河北省正定中学高三联考)胚胎干细胞(ES细胞)具有持续分裂和分化成各种组织细胞的能力。科学家利用已分化的细胞培养出的诱导性多功能干细胞(IPS)，也具备胚胎干细胞的特点，诱导产生IPS细胞前两个阶段为：①分离和培养宿主细胞；②将相关
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